诸葛小菊，陈仁聘，黄燮林，陈超，卢的一，黄智铭，吴金明，吴建胜

    (1.温州医科大学附属第一医院 消化内科，浙江 温州 325015；2.温州医科大学 仁济学院，浙江温州 325035)

    胃癌的发病率高居恶性肿瘤的前4位，其发病过程受到多基因、多因素的影响[1]。越来越多的证据表明抑癌基因的失活在肿瘤发生发展中起重要作用。在胃癌癌变早期，抑癌基因的表观遗传学改变占有重要的地位，尤其是抑癌基因启动子的异常甲基化[2]。

    Lactotransferrin(LTF)基因位于人类染色体3p21.3区域，其在鼻咽癌、肺癌、前列腺癌等多种肿瘤及相应的肿瘤细胞株呈现表达降低或缺失的状态，有研究[3-6]显示这与该基因启动子区域的异常甲基化高度相关。5-Aza-2’-deoxycytidine(5-aza-CdR)能结合DNA甲基转移酶I并使其失活，逆转抑癌基因的高甲基化状态，重新激活基因表达。而目前对于LTF基因在胃癌内的研究尚少，因此本研究选择胃癌细胞株BGC823，观察LTF基因的表达和其启动子甲基化状态，旨在研究胃癌细胞株内LTF基因表达水平和启动子异常甲基化的相关性，为胃癌临床诊断治疗提供一个新的可能靶点。

    1 材料和方法

    1.1 材料 人胃腺癌细胞株BGC823购于中国上海科学院细胞库；胎牛血清购于杭州四季青生物工程材料有限公司；PRMI-1640、PBS、青/链霉素100 U/mL购于Gibco公司；5-aza-CdR(Sigma公司)，用培养基充分溶解配成适量浓度的母液，分装后存于-80 ℃备用；TRIzol购于Invitrogen公司；反转录试剂盒、real-time PCR试剂盒(SYBR?Green Re altime PCR Master Mix)购于日本TOYOBO公司；亚硫酸氢钠修饰试剂盒购于美国ZYMO公司；Ex Taq HS DNA聚合酶、pMD 19-T Vector购于日本TaKaRa公司；抗体anti-Lactoferrin购于美国Abcam公司(77 kDa，1:1 000#ab10110；Abcam，Cambridge，UK)；β-actin antibody购于中国碧云天(42 kDa，1:1 000，Beyotime，中国上海)。荧光定量PCR仪为BIO-RAD(型号CFX96)。

    1.2 方法

    1.2.1 细胞的培养和5-aza-CdR药物处理：BGC82 3细胞用含10%胎牛血清的PRMI-1640培养液放置在37 ℃，5% C02的细胞培养箱内培养 ......