夏立广，李仲荣，刘森清，王永飚，朱利斌，赵一鸣

    (温州医科大学附属第二医院 育英儿童医院 小儿外科，浙江 温州 325027)

    神经递质是发生突触联系的中介，经典神经递质目前已经明确的胆碱类主要为乙酰胆碱(acetylcholine，Ach)，单胺类包括肾上腺素、去甲肾上腺素(noradrenaline，NA)、多巴胺、5-羟色胺，氨基酸类包括谷氨酸、门冬氨酸、γ-氨基丁酸(gammaaminobutyric acid，GABA)、甘氨酸等，以及其他的神经递质包括一氧化氮(nitric oxide，NO)、一氧化碳、前列腺素、P物质、组氨和神经肽等。几乎所有中枢神经系统中的递质均存在于肠神经系统中。本实验研究有代表性的Ach、NO、NA、GABA这4种递质在肠神经干细胞和脑神经干细胞间的差异，为今后如何获得合适的、有功能的、能长期使用的移植干细胞提供理论和实验依据。

    1 材料和方法

    1.1 材料 DMEM/F12、N2-supplement、B27-supplement、青霉素/链霉素、0.25%胰酶-EDTA为Gibco公司产品；bFGF、EGF、粗胶原酶、维甲酸、锥虫蓝为Sigma公司产品；二巯基乙醇、HFN为Chemicon公司产品；兔抗GABA、神经元型一氧化氮合酶(neurona nitric oxide synthase，nNOS)、胆碱乙酰转移酶(choline acetyltransterase，ChAT)、多巴胺β羟化酶(dopamine β-hydroxylase，DβH)、兔IgG同型对照抗体为abcam公司产品；DyLight488荧光二抗为KPL公司产品；酶标山羊抗兔二抗为PTG公司产品；固定通透试剂盒为BD公司产品；DAB显示试剂盒为武汉博士德产品；低熔点琼脂糖为上海捷瑞生物工程有限公司产品；倒置显微镜为Olympus公司产品；流式细胞仪为BD公司产品；CO2培养箱为Thermo公司产品。实验动物为孕20 d的SD大鼠(清洁级)，由温州医科大学实验动物中心提供。

    1.2 培养液及2种神经干细胞原代、传代培养及鉴定方法 从孕20 d的同一SD胚鼠中分别提取肠神经干细胞和脑神经干细胞，采用改良的神经干细胞培养液反复传代，取传代培养6～10 d后得到的2种不同来源的神经细胞球。参见文献[1-2]。

    1.3 神经递质标志物 Ach、NO、NA、GABA这4种递质相对应的标志物分别为ChAT、nNOS、DβH、GABA抗体。

    1.4 琼脂糖预包埋免疫细胞化学检测 本实验选用的一抗分别为：1∶15 000抗GABA ......