陆红，吴莲凤，林成成，王斯璐，梁勇，白永恒

    (温州医科大学附属第一医院，浙江 温州 325015，1.医学检验中心；2.外科实验室)

    Hedgehog(HH)信号最早是在研究果蝇基因突变中被发现，主要由配体sonic hedgehog(Shh)、膜受体Patched 1(Ptch1)、信号开关蛋白Smoothened(Smo)及下游的转录因子Gli1组成[1]。在整个信号通路中，Shh、Smo及Gli1为正调节作用，而Ptch1则起着负调节作用。最近有研究报道，持续异常激活的HH信号可导致胰腺癌、器官纤维化等多种增殖性疾病的发生[2-3]。我们前期研究发现，HH信号参与了肾间质纤维化过程，诱导肾小管上皮细胞发生表型转化和基质累积[4-5]，然而，其机制目前尚不清楚。因此，本研究拟通过外源性重组蛋白Shh来活化HH信号，以及环杷明特异性阻断HH信号的活化，检测肾小管上皮细胞增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)的表达改变，旨在从体外实验角度观察调控HH信号对细胞增殖的影响。

    1 材料和方法

    1.1 材料 DMEM细胞培养液(美国Hyclone公司)；胎牛血清(杭州四季青公司)；胰蛋白酶和TRIzol提取液(美国Gibco公司)；兔抗鼠Ptch1、Smo、Gli1和PCNA单克隆抗体(美国Santa Cruz公司)；RT-PCR试剂(美国Promega公司)；重组蛋白Shh和环杷明(美国PeproTech公司)；MyCycler梯度PCR仪(美国Bio-Rod公司)；7500定量PCR仪(美国Applied Biosystens公司)；Varioskan Flash全波长多功能扫描仪(美国Thermo Scientific公司)；DM4000 B LED荧光正置显微镜(德国Leica公司)。

    1.2 方法

    1.2.1 细胞培养：大鼠肾小管上皮细胞系(NRK-52E)购于中科院上海生命科学研究院细胞资源中心。细胞培养条件为5%胎牛血清的DMEM培养液，置于37 ℃，5% CO2培养箱。实验前，调整细胞至适当密度并铺板于六孔板中 ......