王真，施新颜，陈宇

    (杭州市妇产科医院 检验科，浙江 杭州 310008)

    ·技术与方法·

    红蓝荧光细胞的构建

    王真，施新颜，陈宇

    (杭州市妇产科医院检验科，浙江杭州310008)

    目的：构建人组蛋白H2B基因与蓝色荧光蛋白(BFP)融合的真核表达质粒，使其能在黑色素瘤细胞(B16细胞)中表达，形成在核区可以发出肉眼可见的蓝色荧光，胞质区发出肉眼可见红色荧光的双色荧光细胞。方法：采用普通PCR扩增得到BFP序列，通过反转录PCR(RT-PCR)从含有腺病毒E1A基因的人肾上皮细胞(293细胞)中扩增获得H2B基因的部分cDNA序列。将BFP序列、H2B基因与pRetroX-Tight-Pur载体质粒来构建真核表达质粒(pRetroX-BFP-H2B)，对其进行酶切并用普通PCR方法进行鉴定。采用脂质体转染技术将pRetroX-BFP-H2B重组质粒转染细胞质中能表达红色荧光蛋白(RFP)的B16细胞并观察融合蛋白的表达。结果：成功构建pRetroX-BFP-H2B质粒，经转染后的双荧光细胞可以呈现出双荧光的效果，转染后也能稳定地表达传代。结论：本研究为双色荧光细胞的构建及其荧光蛋白种类的选用提供了新的参考。

    H2B基因；蓝色荧光蛋白；黑色素瘤细胞；真核表达质粒

    荧光蛋白在生物感应器中的巨大应用潜力逐渐被开发出来。利用细胞结构组成信息开发出来的探针可以不断提高生物感应器的敏感度。目前利用荧光蛋白标记细胞核染色体并跟踪观察的技术已经比较成熟，荧光标记技术的成功标志着大部分的生物参数可以采用以荧光蛋白为基础的生物感应器进行测量。故本研究希望通过探索红蓝荧光细胞的构建，为细胞荧光定位设计提供新的思路。

    1 材料和方法

    1.1材料 pRetroX-Tight-Pur载体质粒、PAAV3质粒、黑色素瘤细胞(B16细胞)、人肾上皮细胞(293细胞)、H5α菌种(均由中国疾病控制中心病毒病所提供)；限制性内切酶Mlu1、EcoR1、BamH1，T4 DNA连接酶，Pyrobest DNA聚合酶，rTaq DNA聚合酶(均由TaKaRa公司提供)；质粒小提试剂盒(由天根生化科技有限公司提供)；普通DNA产物纯化试剂盒(由天根生化科技有限公司提供)；RNAisoTM Plus试剂盒(由TaKaRa公司提供)；PrimeScript One Step RT-PCR Kit Ver.2(由TaKaRa公司提供)；胎牛血清(由杭州四季青生物工程材料有限公司提供)；Dulbecco’s modified eagle medium ......