岑丹维，宋易玲，张婵琼，毛珊珊，叶晓鲜，陈俊，陈韶，朱珊丽，张丽芳

    (温州医科大学分子病毒与免疫研究所，浙江温州 325035)

    ·论 著·

    绿脓杆菌外毒素PE38KDEL重组蛋白原核表达及多克隆抗体的制备

    岑丹维，宋易玲，张婵琼，毛珊珊，叶晓鲜，陈俊，陈韶，朱珊丽，张丽芳

    (温州医科大学分子病毒与免疫研究所，浙江温州 325035)

    目的：通过原核表达系统制备绿脓杆菌外毒素(PE)PE38KDEL重组蛋白，并制备特异性兔免疫血清多克隆抗体。方法：选择PE部分基因(PE38)，并将C端609-613位的氨基酸REDLK突变为KDEL，通过原核密码子优化(http://www.jcat.de)后全基因合成，经Hind I I I和Xho I酶切位点克隆至pET32a(+)原核表达载体，构建pET32a(+)/PE38KDEL重组质粒，将测序正确的重组质粒转化到E.coli BL21(DE3)感受态细菌中，经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达重组PE38KDEL蛋白，经Ni-NTA亲和层析法制备纯化蛋白，采用SDS-PAGE电泳和Western blot法进行鉴定。进一步将PE38KDEL纯化蛋白免疫日本大耳白兔制备PE38KDEL特异性多克隆抗体，并采集免疫前后血清，用ELISA法检测免疫后的抗体反应和效价。结果：成功构建了pET32a(+)/PE38KDEL重组质粒。在原核表达系统中该质粒成功表达并获得纯化的PE38KDEL蛋白。SDSPAGE电泳显示蛋白分子质量约为57 kDa，与预计理论值大小相符合。Western blot法检测结果显示，在分子质量约57 kDa处出现单一条带。通过免疫大耳白兔成功获得PE38KDEL特异性多克隆抗体，抗体效价高达1:60 000。结论：PE38KDEL蛋白可诱导兔产生特异性多克隆血清抗体，且该抗体效价高、特异性强，为进一步研究基于PE38KDEL毒素的生物学和免疫学等功能奠定了基础。

    铜绿假单胞菌；外毒素类；PE38KDEL；多克隆抗体；兔

    绿脓杆菌在自然界分布广泛，常引起人类伤口的化脓性感染，由于感染后脓液和渗出液呈绿色，亦被称为铜绿色假单胞菌，其致病特点为致病力较低但抗药性强。绿脓杆菌分泌的绿脓杆菌外毒素(Pseudomonasaeruginosaexotoxin，PE)可通过抑制细胞蛋白质合成，发挥损伤和杀死细胞的作用[1]。由于这种特性，将PE与特定的载体结合(如单克隆抗体、细胞因子等)组成相应的免疫毒素，可用于肿瘤的靶向治疗研究[2] ......