周文媛，任军，纪元，陈晓明

    (温州医科大学 检验医学院 生命科学学院，浙江 温州 325035)

    乳腺癌是全球女性最常见的癌症。综合乳腺癌诊断和治疗的现状，乳腺癌早期诊断标志物以及药物靶点的发现意义重大[1-2]。GALNT6是N-乙酰氨基半乳糖转移酶(N-acetyl galactosyltransferase，GALNT)家族的重要成员[3]，有报道称它与乳腺癌、胃癌等的发生发展存在一定的相关性[4-6]。它在乳腺癌中呈高表达状态，但其作用机制有待进一步探讨。本研究通过构建GALNT6低表达的MCF-7细胞株，检测GALNT6对乳腺癌细胞MCF-7增殖、迁移等生物学功能的影响。

    1 材料和方法

    1.1 材料

    1.1.1 细胞与载体：乳腺癌细胞MCF-7购自上海中国科学院细胞库。GALNT6的RNA干扰载体pGPU6/GFP/Neo-GALNT6和对照载体pGPU6/GFP/Neo-shNC均由上海吉玛技术有限公司设计合成。

    1.1.2 试剂：胎牛血清FBS为美国Hyclone公司产品，RPMI 1640培养基为美国Gibco公司产品，胰酶细胞消化液、青霉素-链霉素溶液(100×)、辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG、辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG和β-Actin小鼠单克隆抗体均购于上海碧云天生物技术研究所，CCK8试剂购于日本同仁株式会社，细胞周期检测试剂盒购于南京凯基生物科技发展有限公司，GALNT6兔多克隆抗体购于美国Abcam公司，PCNA兔单克隆抗体购于美国Cell Signaling Technology公司，Prime Script RT Reagent Kit购于大连宝生物公司。

    1.2 方法

    1.2.1 细胞培养：将细胞置于含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的RPMI 1640培养液中，用25 mL透气细胞培养瓶放在CO2培养箱中培养(37 ℃、5% CO2、95%湿度)。实验共分3组：Mock组：未转染组，NC组：空载体对照组，sh-GALNT6组：GALNT6低表达组。

    1.2.2 Real-time PCR：采用Trizol法提取细胞总RNA，ND2000测定RNA浓度，同时观察样品OD260/OD280比值，比值在2.0左右时表示所提取的RNA纯度较高，可用于下一步实验。反转录过程根据试剂盒说明配制反应体系(20 μL)：4 μL 5×Prime Script Buffer、1 μL Prime Script RT Enzyme Mix I、1 μL Oligo dTPrime、1 μL Random 6 mers(100 μL)、0.5 μL样品RNA、 (12.5)μL RNase free H2O ......