蒋伟青，袁欣，刘晨，任潇，王永刚

    (1.上海交通大学医学院附属仁济医院 神经内科，上海 200127；2.郑州大学第一附属医院 神经内科，河南 郑州 450052)

    阿尔兹海默病(Alzheimer’s disease，AD)病理学特点表现为脑内淀粉样斑块和神经原纤维缠结[1]。淀粉样斑块由β-淀粉样蛋白(β-amyloid protein，Aβ)沉积所形成，而Aβ由淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein，APP)经过蛋白水解作用而产生，APP代谢异常会导致Aβ的产生和清除失衡而导致Aβ过度沉积[2-3]。凋亡参与许多神经退行性疾病如AD的神经元死亡过程[4]。生存素(survivin)是凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein，IAP)家族的重要成员之一，在抑制凋亡和调控细胞分裂中起重要作用[4]。本研究探讨survivin对APP代谢的调节作用。

    1 材料和方法

    1.1 材料 原代大鼠海马神经元、PC12细胞购自上海赛傲公司。survivin抗体、APP抗体及GAPDH内参抗体购自英国Abcam公司。细胞凋亡检测试剂盒购自上海翊圣公司。Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司。

    1.2 方法

    1.2.1 免疫荧光技术：细胞爬片用PBS浸洗后，用4%多聚甲醛固定15 min，PBS浸洗后，0.5% Triton X-100(PBS配制)室温通透20 min，PBS浸洗后用山羊血清室温封闭30 min，4 ℃孵育一抗过夜，PBST浸洗后，室温避光孵育荧光二抗，PBST浸洗后，封片，在荧光显微镜下观察采集图像。

    1.2.2 质粒转染：转染前1 d，将细胞接种到6孔板。次日，吸尽培养基，用Opti-MEM培养基洗涤细胞2次。对于每孔细胞，用200 μL Opti-MEM培养基分别稀释空载体1 μg、HA-APP质粒1 μg、HAAPP质粒和GFP-survivin质粒[5]各1 μg，混匀放置10 min后将Lipofectamine 2000与质粒混合，混匀后室温放置25 min，加入到6孔板的细胞中推匀，将培养板放入37 ℃孵育，转染48 h后进行蛋白提取或凋亡染料染色。

    1.2.3 Western blot：利用CockTail/RIPA(1∶100)裂解细胞提取总蛋白 ......