张杰，秦华丽，蒋明

    (1.温州医科大学附属第一医院 耳鼻咽喉头颈外科，浙江 温州 325015；2.长沙市妇幼保健院 耳鼻咽喉头颈外科，湖南 长沙 410007；3.中南大学湘雅三医院 耳鼻咽喉头颈外科，湖南 长沙 410013)

    近年来骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)治疗神经退行性病变日益受到学者重视。BMSCs具有高度自我复制能力和多向分化潜能，且在适宜条件下能向神经元样细胞分化[1]。目前最常见的诱导剂为神经营养因子与化学制剂。本研究比较碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)预诱导后，再用神经营养因子-3(neurotrophin-3，NT-3)联合全反式维甲酸(retinoic acid，RA)与β-巯基乙醇(beta-mercaptoethanol，β-BME)进行分步诱导的方法来体外诱导BMSCs向神经元样细胞分化的效果差异。

    1 材料和方法

    1.1 材料 澳洲胎牛血清、0.25%胰酶-0.02%EDTA、青链霉素购自美国Gibco公司；PE anti-rat CD29、CD90、CD45、IgG1购自美国BioLegend公司；β-BME、bFGF、RA、NT-3购自美国PeProtech公司；Cy3标记山羊抗兔IgG(H+L)购自上海碧云天公司；L-DMEM培养基购自美国Hyclone公司；大鼠抗山羊神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific endase，NSE)购自武汉博士德公司；4～6周龄，40～60 g雄性SD大鼠购自中南大学湘雅三医院动物实验中心，动物许可证号为SYXK(湘)2014-0013。

    1.2 方法

    1.2.1 分离培养大鼠BMSCs：用腹腔注射水合氯醛麻醉后，无菌条件下取大鼠股骨和胫骨，用2 mL注射器抽取含10%胎牛血清的DMEM培养基反复冲洗骨髓，离心去上清，以1×105个/mL的细胞密度接种于25 cm2细胞透气培养瓶内 ......