陈洁，次晓蕊，张娟娟，2，管敏鑫

    (1.温州医科大学检验医学院生命科学学院，Attardi线粒体生物医学研究所，浙江温州325035；2.温州医科大学附属眼视光医院科研中心，浙江温州325027)

    Leber遗传性视神经病变(Leber’shereditaryopticneuropathy，LHON)是一种线粒体母系遗传性疾病。该病主要累及视网膜、巩膜筛板前部视乳头黄斑束纤维，导致视网膜神经节细胞退行性病变[1]，主要表现为视力同时或先后进行性的减退，单侧或双侧眼均可累及，可同时伴有中心视野缺失及色觉障碍，部分患者的视力经治疗后可好转。除了三大原发性突变外，还发现了m.3376G>A、m.3394G>A、m.4640C>A、m.12338T>C、m.14325T>C等继发突变与LHON相关[2-5]。在LHON家系中，可以发现各年龄均可发病，以青壮年男性居多。研究表明，线粒体单体型与许多疾病的发生密不可分[6-8]。为分析线粒体单体型对LHON外显率的影响，本研究对搜集的血液标本进行m.3460G>A的筛查、家系调查、线粒体单体型及保守性分析。

    1 对象和方法

    1.1 对象 本课题组自2004年起在全国范围内收集了1218例LHON血样，同时采集376例正常人群的静脉血做对照，经温州医科大学伦理委员会批准，所有受检者签署知情同意书，并采集外周静脉血4mL(EDTA-K2抗凝)或制成滤纸片。

    1.2 方法

    1.2.1 眼科临床检查：对LHON患者及部分家系成员进行眼科临床检查，包括标准对数视力表检测视力、色觉检查、视野计检查视野、电生理仪检测视觉诱发电位等。视力损害程度参照世界卫生组织标准：正常>0.3；0.1≤轻度≤0.3；0.05≤中度<0.1；0.02≤重度≤0.05；极重度<0.02。

    1.2.2 线粒体DNA提取、PCR扩增及测序：将收集到的外周静脉血或者血滤纸片用经典的酚-氯仿法提取线粒体DNA、测浓度，接着对m.3460G>A突变所在的片段通过正向引物5’-TACTTCACAAAGCGCCTTCC-3’和反向引物5’-ATGAAGAATAGGGCGAAGGG-3’进行PCR扩增、1.5%的琼脂糖凝胶电泳验证，扩增条件以及检测方法见参考文献[9] ......