何林杰，廖鑫，潘逸男，黄义星

    (温州医科大学附属第二医院育英儿童医院 骨科，浙江 温州 325027)

    近年来由于经济水平的提高及人口的老龄化，因运动损伤、交通意外及骨性关节炎等导致的软骨缺损发生率急剧上升，其导致的关节疼痛、功能障碍等症状严重影响着人们的生活质量[1]。但由于关节软骨本身无血供，且缺乏修复损伤的未分化细胞，加之软骨细胞的低代谢活性和高密度的细胞外基质的限制，使得其自身修复能力非常有限。目前的治疗方法主要包括关节清理术、微骨折术、自体或异体骨软骨移植、人工关节置换术等，这些治疗方法均存在明显的不足，如远期疗效不佳、高额的治疗费用、有限的供体来源及免疫排异等[2-3]。本研究拟制备一种可注射且能缓释TGF-β3的去细胞软骨微丝/温敏型水凝胶复合支架，并探讨其诱导骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BMSCs)成软骨分化的情况，期望能为临床上治疗软骨缺损提供一种新的思路。

    1 材料和方法

    1.1 材料 由温州医科大学实验动物中心提供4周龄，体质量为160～200 g的雄性SPF级SD大鼠，实验动物许可证号：SYXK(浙)2015-0009。透明质酸(hyaluronic acid，HA)、聚乙烯亚胺(polyethyleneimine，PEI)、碳化二亚胺盐酸盐(carbodiimide hydrochloride，EDC)、羟基硫代琥珀酰亚胺(sNHS)购自上海阿拉丁公司；苯甲基磺酰氟(phenylmethyl sulfonyl fluoride，PMSF)、聚赖氨酸(polylysine，PLL)、TritonX-100购自美国Sigma公司；Tris-HCl、Dnase、RNase购自北京索莱宝公司；SD大鼠BMSCs成软骨诱导分化培养基试剂盒购自美国Cyagen Bioscience公司；TGF-β3购自美国Peprotech公司；Collagen II(Col II)抗体、Aggrecan(AGG)抗体、GAPDH抗体、DAPI购自美国Abcam公司；CCK-8试剂盒购自日本Dojindo公司；SOX9抗体购自美国Cell Signal Technology公司；BCA蛋白浓度试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。

    1.2 方法

    1.2.1 去细胞软骨微丝的制备：①无菌条件下获取兔新鲜肋软骨，置于含蛋白酶抑制物PMSF的 10 mmol/L Tris-HCl缓冲液中离心5 min，清洗3次，低温组织粉碎机粉碎软骨组织 ......