蒋永生，张梦佩，韩春婵，黄立江

    (温州医科大学附属象山医院，浙江 宁波 315700，1.科教管理中心；2.消化内科)

    外周神经损伤(peripheral nerve injury，PNI)会导致支配区域出现运动和感觉的丧失并诱发剧烈的神经疼痛，严重影响患者的生活质量[1]。临床治疗中，自体神经移植仍然被视为修复缺损神经的“金标准”[2]。但由于存在来源受限、获取组织的个体差异及术后并发症等原因，致其应用受限[3-4]。 为解决这一难题，研究人员尝试利用去细胞后的异种组织对PNI进行修复。由于猪神经和人神经的基因序列和结构形态极为相似，故将自体神经及其制备的产品替换为去细胞后的猪神经组织并运用于PNI的修复成为目前研究的热点[5]。本研究通过蛋白质组学分析方法，对人神经脱细胞基质(human decellularized nerve matrix，hDNM)和猪神经脱细胞基质(porcine decellularized nerve matrix， pDNM)存在的差异蛋白进行GO和Pathway分析，同时绘制2组脱细胞基质相关蛋白的热图，为开发猪神经生物材料并运用于PNI的临床治疗提供支撑。

    1 材料和方法

    1.1 材料 hDNM购自广州中大医疗器械有限公司[商品名：神桥；批准文号：国食药监械(准)字2012第3460641号]。pDNM委托广州中大医疗器械有限公司生产。

    1.2 方法

    1.2.1 蛋白质提取：pDNM(3个样)和hDMN(6个样)共计9个样品，4 ℃冻融并用预冷的PBS清洗2次，以去除样本中残留液体。将组织迅速置于-80 ℃ 预冷的研磨钢管中，加入钢珠，使用上海净信全自动样品快速研磨仪(型号：JXFSTPRP-32)，研磨 1 min。往研磨钢管中加入1 mL的SDS裂解液(上海碧云天，P0013G)，于冰上反应30 min(每隔10 min涡旋1 min)。将研磨钢管中的蛋白质裂解液转移至新的EP管，170 000×g，4 ℃离心30 min，取上清液至新的EP管中并运用BCA法检测各样本蛋白质浓度。

    1.2.2 蛋白质酶解：将各个样品50 μg的蛋白质转移到新试管中，加入DTT到样品中使其终浓度为 20 mmol/L，在37 ℃中反应1 h。随后，加入 60 mmol/L的IAA，避光于室温进行烷基化反应 30 min。反应完成后加入6倍体积的冷丙酮， -20 ℃沉淀5 h。然后，于4 ℃中1 000×g离心收集蛋白沉淀，再用冷丙酮洗一次沉淀体 ......