张智勇，裘丰

    (宁波医疗中心李惠利医院东部院区 胃肠外科，浙江 宁波 315040)

    结直肠癌(colorectal cancer，CRC)是全球发病率、病死率均较高的恶性肿瘤[1]。表皮生长因子受体(epithelial growth factor receptor，EGFR)是上皮肿瘤中最重要的原癌基因之一，72%～89%的CRC组织中存在EGFR的高表达[2]。西妥昔单抗(Cetuximab)通过与EGFR内源性配体竞争性结合，阻断下游酪氨酸激酶的激活，进而发挥抗肿瘤作用，是晚期CRC的一线治疗药物，但患者均易发生西妥昔单抗继发性耐药，找到发生耐药的机制对 于临床治疗方案具有重要的指导意义。抑癌基因PTEN的丢失是导致CRC对西妥昔单抗耐药的重要因素[3]，但其丢失的机制仍有待揭示。非编码RNA(non-coding RNA，ncRNA)作为机体内广泛表达的表观调控因子，参与多种生物学过程，包括肿瘤的发生发展[4-5]。本研究通过生物信息分析发现长链非编码RNA(long non-coding RNA，LncRNA)Linc00658 可能通过micro RNA-19a-3p(miR-19a-3p)调控PTEN的表达，进而影响CRC细胞西妥昔单抗的敏感性。

    1 材料和方法

    1.1 材料

    1.1.1 细胞：人肾上皮细胞293T、人CRC细胞CaCo2(美国ATCC)。

    1.1.2 试剂：Cetuximab(美国Selleck公司)，DMEM、RPMI-1640培养基及FBS(美国Gibco公司)，DMSO、双抗及CCK-8试剂(美国Sigma-Aldrich公司)，miRNA Control及miR-19a-3p mimic(上海汉恒生物公司)，Linc00658过表达载体及Vector对照载体(上海吉凯基因公司)，Lipofectamine 2000(美国Thermo Fisher公司)，PTEN、磷酸化AKT(p-AKT)及磷酸化mTOR(p-mTOR)抗体(美国Cell Signaling Technology公司)，TRIzoL及SuperScript IV反转录试剂盒(美国Invitrogen公司)，SYBR Green(美国MedChemExpress公司)，Passive Lysis Buffer、Luciferase Assay Reaget、pGL3-basic Vector(美国Promega公司)。

    1.1.3 仪器：iMark酶标仪、ChemiDoc XRS+化学发光成像仪(美国Bio-Rad公司) ......