狄枫，吴秀娟，沈水娟，郭波尧

    绍兴市人民医院，浙江 绍兴 312000，1.呼吸科；2.肾内科

    血管钙化是动脉粥样硬化、糖尿病血管病变、慢性肾脏病(chronic kidney dielace，CKD)等多种疾病的共同病理生理过程。在肾小球滤过率降低的CKD患者中，血管钙化发生率可达89%[1]。CKD患者的血管钙化并不是简单的钙磷被动沉积过程，而是血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，VSMC)在CKD环境中经历凋亡和囊泡形成，并向成骨样细胞表型转换，进而诱导钙化蛋白表达，基质形成并吸收钙磷沉积的主动过程[2]。在这一过程中，血管钙化是钙化促进因素和抑制因素不平衡的结果。我们的前期研究发现，维生素D3 联合尼古丁(vitamin D3 and nicotine，VDN)血管钙化模型的大鼠在停止药物干预后，血管钙化可发生自行消退，在这一过程中，外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶1(ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase 1，ENPP1)基因高表达[3]。为此，本研究通过采用克隆编码ENPP1蛋白cDNA并构建其重组腺相关病毒(adeno-associated virus vector，AVV)，以便为后续研究其在血管钙化抑制中的作用及基因治疗提供技术条件。

    1 材料和方法

    1.1 试剂和仪器 主要试剂：DH5α感受态细胞(Takara，日本)；高纯度质粒小量中提试剂盒(北京天根生化有限公司)；DNA引物合成(上海捷瑞公司)；Qiagen大规模质粒抽提试剂盒(Qiagen，德 国)；DNA内切酶和T4 DNA连接酶(DNA marker，上海赛默飞)；DNA凝胶回收试剂盒(Omega，美国)；PCR产物纯化试剂盒(Axygen，美国)；Pav-fh AAV9载体(Vigenebio，美国)。主要仪器：全波长酶标仪、超微量高精度分光光度计、落地式培养摇床(美国Thermo公司)；超速离心机(日本Hitachi)；pH计(德国Mettler toledo公司)；倒置显微镜(日本 Olympus)；实时荧光定量扩增仪(美国Bio-Rad)；荧光显微镜(日本Nikon)；CO2培养箱(日本Sanyo)； 超净工作台、生物安全柜(苏州安泰空气技术有限公司)。

    1.2 方法

    1.2.1 克隆大鼠ENPP1基因大片段：提取8周龄雄性SD大鼠的血管中膜平滑肌组织。确定大鼠目的基因ENPP1，NM053535.1；序列全长2 721 bp ......