方练，陈霖，林碧

    温州医科大学附属第一医院，浙江 温州 325015；1.耳鼻咽喉科；2.病理科

    中耳胆脂瘤是颞骨内角质化细胞异常增生性病变，是上皮细胞强烈增殖、角蛋白碎屑大量堆积形成的上皮样囊袋[1-2]，胆脂瘤侵袭性生长可破坏周围骨质，导致各种颅内外并发症，如迷路炎、周围性面瘫和脑脓肿等[3-4]。胆脂瘤中的免疫细胞释放炎症递质，导致咽鼓管功能障碍和中耳黏膜纤毛清除功能减退，中耳细菌产物堆积，造成感染的恶性循环。胆脂瘤的异常增殖可能与过度炎症有关，其具体分子机制目前尚不明确。

    巨噬细胞是机体免疫的关键组成部分，能够辨认共生抗原，清除病原体和代谢物，维持组织稳态，如果这一过程被破坏，将产生过度的免疫反应，促进组织炎症的发生和发展，可能导致上皮增殖失控和胆脂瘤生成[5]。

    不同部位的巨噬细胞具有转录和功能差异，并由其基因表达谱所决定[6]。本研究通过RNA-Seq方法[7]检测中耳胆脂瘤巨噬细胞的基因表达谱，筛选出差异表达基因，探讨其在中耳胆脂瘤中的生物学功能及信号通路。

    1 对象和方法

    1.1 对象 选取2018年1月至12月温州医科大学附属第一医院耳鼻咽喉科行乳突切除术的慢性化脓性中耳炎患者共57例，经手术探查及HE染色病理检查，其中12例为中耳胆脂瘤，45例为非胆脂瘤型中耳炎。术中分别收集中耳胆脂瘤患者的胆脂瘤基质周围组织和非胆脂瘤型中耳炎患者的中耳肉芽组织。随机抽取3例中耳胆脂瘤标本为试验组，3例非胆脂瘤型中耳炎标本为对照组。

    1.2 方法

    1.2.1 组织巨噬细胞分离：将收集的标本组织切成小块，在37 ℃ Hank’s液中孵化30 min。用细胞滤网采取吸液和机械分离的方式得到单细胞悬液。用抗人CD14免疫磁珠抗体(购自美国BD公司) 标记巨噬细胞，置于BD IMag的磁场中，CD14+细胞因向磁体迁移而得以分离，重复分离2次后用流式细胞仪检测CD14+细胞的百分比。

    1.2.2 总RNA提取、文库构建：用Hank’s液调整细胞悬液浓度至105～106/mL，使用总RNA提取试剂盒(购自南京诺维赞生物科技有限公司)从每个样本中提取总RNA，使用RNA-Seq文库制备试剂盒(购自南京诺维赞生物科技有限公司) ......