潘嘉林，林丛，周莉莉，黄明远，陈晔

    温州医科大学附属第二医院育英儿童医院 心血管内科，浙江 温州 325027

    MicroRNA(miRNA)是一类长约21～25个核苷酸的非编码单链小分子RNA。miRNA在几乎所有的病理过程中发挥着至关重要的作用。miR-34a已被证明可以调节多种靶向蛋白，调控细胞周期和凋亡等。与其他器官相比，miR-34a在心肌梗死后的心脏组织中高表达，这结果为研究慢性心力衰竭治疗的新策略提供依据[1]。已有研究发现，沉默整个miR-34家族可以保护心肌梗死后心脏的病理性结构重 构[2]。但在心肌缺血的情况下，miR-34对心肌细胞的作用和具体机制目前尚未明了。本课题组前期研究表明，miR-34a在大鼠心肌梗死后的心肌细胞中表达增加，可能具有促进心肌细胞凋亡的作用[3]。本研究设计体外培养大鼠心肌细胞，进一步探讨miR-34a是否通过Notch1通路调节心肌细胞凋亡及其具体机制。

    1 材料和方法

    1.1 细胞培养 大鼠心肌细胞株H9C2培养在含10% FBS的DMEM培养基中，培养条件：恒温37 ℃、1% O2、94% N2、5% CO2，平均3 d进行一次传代培养。

    1.2 转染和分组 经传代培养后的H9C2细胞接种到6孔板中，再转染5 μL的FAM-miRNA或siRNA，以Lipofectamine 2000(5 μL)为转染介质。实验分6组：①miR-34a组：转染miR-34a mimics；②miR-NC组：阴性对照细胞，转染随机合成NC microRNA片段；③miR-inhibitor组：转染miR-34a inhibitor；④siRNA+miR-inhibitor组：先转染siRNA-Notch1，再转染miR-inhibitor；⑤siRNA-NC+miR-inhibitor组：先转染随机合成NC siRNA片段，再转染miRinhibitor；⑥normal组：正常培养的细胞，作空白对照。转染后培养箱中继续培养24～48 h。

    1.3 miR-34a mimics、miR-34a inhibitor和siRNA-Notch1片段的合成 由上海吉玛公司设计并合成。miR-34a mimics序列：正义链：5’-UGGCAGUGU CUUAGCUGGUUGU-3’，反义链：5’-AACCAGCUAAGACACUG CCAUA-3’；miR-34a inhibitor序列：5’-ACCGUCACAGA AUCGACCAACA-3’；siRNA-Notch1序列：5’-TTGGGACAGG UAUACCAAACA-3’ ......