饶大庞，项之洋，虞海峰

    温州医科大学附属第二医院育英儿童医院 泌尿外科，浙江 温州 325027

    前列腺癌是第二常见的男性恶性肿瘤，也是男性癌症死亡的第四大原因[1]。亚洲男性前列腺癌的发病率和病死率在过去几十年里迅速上升，大多数患者就诊时已为晚期[2]。本课题检测cGMP依赖蛋白激酶(cGMP dependent protein kinase type I，PRKG1)在前列腺癌中的表达，研究PRKG1敲除对前列腺癌细胞的影响，为探寻前列腺癌新的治疗靶标提供思路[3]。

    1 材料和方法

    1.1 材料 75例前列腺癌组织和12例正常前列腺组织及相关临床资料由西安艾丽娜生物科技有限公司提供，包括PRKG1表达组织芯片免疫组化结果、前列腺癌的临床病理特征(组织病理学和组织学分级)。肿瘤分期参照美国癌症联合委员会(AJCC)第8版。病理特征评价采用Gleason评分。本研究通过温州医科大学附属第二医院医学伦理委员会审查批准(伦理审批号：2021-K-01-01)。

    抗PRKG1、β-微管蛋白(β-Tubulin)、基质金属蛋白酶-9(matrix metallopeptidase 9，MMP9)、埃兹蛋白(Ezrin)、钙黏附蛋白-2(cadherin-2，CDH-2)、Bax、Bcl-2及钙黏附蛋白-1(cadherin-1，CDH-1)的一抗购自英国Abcam公司，山羊抗兔二抗(pv6001)购自北京中衫金桥公司。细胞培养试剂购自美国Gibco公司。人前列腺癌细胞系22RV1购自上海烜雅生物科技有限公司。携带Cas9和gRNA的质粒载体由杭州擎科生物科技有限公司构建及验证。CCK8试剂盒购自日本同仁化学研究所。DAB显色试剂盒20×(ZLI-9018)购自北京中衫金桥公司。

    1.2 方法

    1.2.1 免疫组化：组织微阵列玻片的HE染色采用标准程序进行。载玻片经二甲苯脱蜡、乙醇漂洗、重新水化。抗原修复采用枸橼酸缓冲液。将阵列浸泡在3%过氧化氢缓冲液中30 min来淬灭内源性过氧化物酶。用PRKG1一抗(1:50)孵育后，4 ℃过夜(16～18 h)。37 ℃水浴复温30 min，PBS浸泡5 min 3遍。滴加二抗，常温20 min；PBS浸泡5 min 3遍。DAB显色，随后自来水冲洗 ......