陈赛玲，王芳，陈慧倩，胡雪莉，吴妹玲，段萍

    温州医科大学附属第二医院育英儿童医院 妇产科，浙江 温州 325027

    子宫内膜异位症(endometriosis,EMs)是具有盆腹腔局部免疫功能异常的妇科常见病。其中，巨噬细胞是含量最多的免疫细胞。此外，EMs相关巨噬细胞(endometriosis-associated macrophages,EAMs)的M2表型被发现在EMs患者异位病灶中占主导地位，可分泌相关炎症因子，而炎症因子之间动态相互作用的失调可导致逆流子宫内膜碎片逃脱免疫清除并在异位种植生长，其中免疫起着关键性作用。那么如何从EMs病灶中分离、提纯巨噬细胞是深入进行EMs免疫相关体外研究的关键，目前国内外鲜见关于EAMs提取方法的报道。本研究拟利用酶消化法和密度梯度离心法分离EAMs，并进行贴壁培养和鉴定，探讨此法提取EAMs的可行性。

    1 材料和方法

    1.1 材料

    1.1.1 标本：本研究免疫组织化学组织切片均取自温州医科大学附属第二医院育英儿童医院病理科，选取7个EMs患者的异位病灶(卵巢、膀胱壁、腹壁、腹直肌、盆腔等)；7个正常内膜组织(宫颈上皮内瘤变II-III级)作为对照。原代细胞提取3例EMs病灶标本均取自于温州医科大学附属第二医院育英儿童医院妇科，经腹腔镜以及病理确诊为EMs的异位病灶组织。用于免疫组织化学的病理切片人体组织标本已通过医院伦理委员会审批且取得患者的知情同意。

    1.1.2 试剂：免疫组织化学抗体CD68、CD163购自美国Abcam公司；免疫组织化学检测试剂兔二步法试剂盒、DAB显色液购自北京中衫金桥公司，山羊血清、枸橼酸钠缓冲液均购自北京索莱宝公司；流式细胞检测抗体Fc Receptor Blocking Solution LIVE/DEAD-APC/Cy7、CD11b-APC、CD163-PE、CD80-PE/Cy7抗体均购自美国Biolegend公司；用于原代细胞培养的胶原酶(Type IV)购自德国Worthington公司，透明质酸酶、DNA酶、组织淋巴细胞分离液试剂盒(主要包括各种组织淋巴细胞分离液、全血及组织稀释液、细胞洗涤液)购自北京索莱宝公司；RPMI1640培养基和胎牛血清均购自美国Gibco公司。

    1.2 方法

    1.2.1 免疫组织化学染色：将获得的标本制成厚度2 μm的切片 ......