洪子璞，张文振，陈聪德

    温州医科大学附属第二医院育英儿童医院，浙江 温州 325027，1.创面外科；2.小儿外科

    胚胎及出生个体的生长发育是个相当复杂的过程，涉及到多个系统及组织。其中，内分泌系统的多种激素的缺欠可以导致生长发育迟滞。斑马鱼饲养成本低，便于大规模养殖，同时由于体外受精，体外发育，且其发育周期短，透明易观察，与人类相关的84%疾病基因在斑马鱼体内均能表达[1]，正日渐成为重要的模式动物[2]。ELAVL1又名HUR，是一种可在细胞核内编码的RNA结合蛋白，在机体内全身性表达，除了对细胞增殖、分化具有重要的作用之外[3]，近期还有研究显示它可以影响肠神经系统发育[4]，也可能影响甲状腺激素及生长激素的分泌及生理作用[5-6]，以上均提示ELAVL1的表达异常将可能引起生长发育障碍。为了探究ELAVL1对个体发育及生长的影响，本文通过运用CRISP-Cas9技术定向敲除斑马鱼5个核苷酸序列，从而提前终止蛋白翻译来影响elavl1a蛋白的表达，来获得斑马鱼敲除elavl1a后生长发育迟滞的模型，并为后续探究其可能的机制做前期工作。

    1 材料和方法

    1.1 动物及饲养繁育材料 野生AB型斑马鱼品系(D.rerio)从国家斑马鱼资源中心购买，参照斑马鱼手册进行标准化养殖[7]。野生型和突变型胚胎在胚胎培养液(E3：0.5 mmol/L氯化钠，0.17 mmol/L氯化钾，0.33 mmol/L氯化钙，0.33 mmol/L氯化镁)中于28.5 ℃进行培育。按照10 L的水缸放置15条成鱼的标准养殖，在14 h光照、10 h黑暗的周期下，每天进行循环换水。产卵前，提前1 d将鱼按照雌雄1∶1的比例放入一个水槽中并用隔板分开，第2天灯亮后拔出隔板进行交配。2个月以上的斑马鱼通过剪尾鳍提取DNA进行基因型鉴定。

    1.2 主要试剂与仪器 Taq DNA聚合酶、T7 RNA Polymerase-PlusTMEnzyme Mix、Nanodrop2000/2000C分光光度计购于美国Thermo Fisher公司，Pyrobest DNA Polymerase、dNTP购于日本TAKARA公司，DR274质粒与MLM3613质粒购于美国Addgene公司 ......