陈健，李利义，诸葛林敏，马香爱，朱岳升，俞耀军

    温州医科大学附属第二医院育英儿童医院，浙江 温州 325027，1.胃肠外科；2.手术室；3.消化内科

    胃癌是恶性肿瘤死亡的第四大原因，尽管目前临床上进行的化疗、放疗、手术治疗以及一些分子靶向治疗能够显著延长胃癌患者的生存期，但其5年生存率依然很低[1]，因此，进一步研究胃癌发生的分子机制，寻找胃癌患者新的治疗靶点并采取针对性的治疗策略具有重要的意义[2]。复制蛋白A1 (replication protein A1, RPA1)是三聚体复制蛋白A的最大亚基，在真核细胞DNA复制、同源重组和切除修复中起核心作用，其在食管癌、结肠癌、尿路上皮癌等多种癌症中均被扩增[3-5]。有研究发现，RPA1在胃癌中呈现高表达，与患者的临床特征、预后之间存在相关性[6]，但是，具体机制尚不清楚。微小RNA(microRNA, miRNA)是一类小分子非编码单链RNA，在转录后水平抑制靶mRNA的翻译或降解mRNA， 参与调控细胞的增殖、分化和凋亡等。研究显示，miR-30a在胃癌和卵巢癌细胞中通过靶向调控RPA1基因的表达进而抑制细胞增殖[7]，但miRNA与RPA1在胃癌中的相互作用尚不明确，因此，本研究在胃癌细胞中通过RNA pulldown技术探究了RPA1结合的miRNA，结果发现miR-145在胃癌细胞中靶向结合并调控RPA1基因的表达，进而抑制胃癌细胞的增殖。

    1 材料和方法

    1.1 细胞和主要试剂 胃癌SGC-7901细胞(中科院细胞库)，FBS、RPMI 1640培养基(美国Gibco公司)，胰蛋白酶、脂质体2000、TRIzol试剂(美国 Invitrogen公司)，miRNA分离试剂盒(美国Ambion公司)，All-in-One miRNA qRT-PCR检测试剂盒(美国Gene Copoeia公司)，has-miR-145模拟物、miRNA对照物(上海吉玛制药技术有限公司)，生物素标记的RNA pulldown探针(生工生物工程(上海)股份有限公司)，RNA pulldown试剂盒(上海泽恒生物科技有限公司)，RPA1抗体(美国Abcam公司)，辣根过氧化物酶标记兔抗鼠二抗(美国CST公司)，双荧光素酶活性检测试剂盒(美国Promega公司)，包含RPA1基因3’-非翻译区(3’UTR)荧光素酶报告载体由上海吉凯基因公司包装合成。

    1.2 RNA pulldown回收实验 使用RNA pulldown试剂盒进行RNA回收实验 ......