CML生物治疗的实验研究*(1)
[摘要]：慢性粒细胞白血病是一种造血干细胞的恶性克隆增殖性疾病，以分子生物学、免疫学为基础的生物治疗手段成为新的研究方向，生物治疗主要包括分子靶向治疗、基因治疗和过继免疫治疗。基因治疗主要通过基因转染使肿瘤细胞抗原标志过度表达而增加机体的免疫识别；或通过下调相关原癌基因表达，抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡等方式发挥抗肿瘤作用。过继免疫治疗是通过将CIK、NK等免疫活性细胞注入肿瘤宿主体内的一种治疗方法。基于K562细胞系的相关研究为深入进行生物治疗研究奠定了基础，但因缺乏合适靶标等原因，生物治疗尚不能取代传统的治疗方法，故还需进一步深入研究。
[关键词]：慢性粒细胞白血病；过继免疫治疗；基因治疗；K562细胞
慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia， CML)是一种造血干细胞的恶性克隆增殖性疾病。目前证实唯一可以治愈CML的手段是进行骨髓或外周血干细胞移植，但移植风险较大，供体缺乏，治愈率偏低，因此寻找新的治疗方法成为了目前的研究热点。而肿瘤细胞的生物治疗是以分子生物学、免疫学等前沿科学为基础，通过调节或增强机体原本固有的内在防御机制，达到抑制或消除恶性肿瘤的目的，主要包括分子靶向治疗、免疫治疗、基因治疗等。下面将就CML的发病机制，CML的基因治疗和免疫治疗的基础研究进展等进行总结和回顾。
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一、CML的发病的分子机制
慢粒表现为Ph染色体t (9； 22) (q34； q11) 阳性的细胞遗传学特征，Ph染色体由位于第9号染色体的c-abl原癌基因与第22号染色体bcr基因相互易位形成表达P210bcr-abl融合蛋白的bcr-abl融合基因。P210bcr-abl融合蛋白具有异常活跃的酪氨酸激酶活性(PTK)，导致造血细胞过度增殖，减少细胞对骨髓基质的黏附性，破坏造血细胞、基质细胞与细胞内粘附分子介导的膜信号的相互作用，导致细胞凋亡障碍。该融合蛋白上包含位于abl区的酪氨酸激酶结构域、SHZ和SH3结构域、核定位信号区、DNA结合区和肌动蛋白结合区，位于bcr区的卷曲螺旋结构域、PH结构域、丝/苏氨酸激酶结构域和第177位酪氨酸，这些功能结构域通过衔接蛋白分子，如GRB-2、SHC、CRKL、CBL等相互作用，可激活Ras-Raf-MAPK、STAT-Bcl-XL、PI3K-AKT、NFκB等多条信号转导通路，促进抗凋亡蛋白Bcl-XL的表达，抑制Bad、Bax、Bak、Bim、Bid等促凋亡蛋白的活性，维持线粒体结构稳定，抑制线粒体释放CytC、AIF、EndoG、Smac/Diablo等促凋亡蛋白，阻止Caspase-3的活化和DNA片段化，抑制细胞凋亡[1-6]。
, 百拇医药
二、 CML基因治疗的实验研究
基因的治疗方式可以表现在以下几个方面：
1.通过基因转染使肿瘤细胞的某种抗原标志过度表达，从而增加机体免疫系统的免疫识别，从而抗肿瘤作用。梁伟等[7]采用针对DNMT家族不同成员的siRNA转染K562细胞， 探讨了抑制甲基转移酶(DNMT)对K562细胞中癌-睾丸抗原(cancer-testis antigen， CTA)表达的影响。通常正常人的外周血细胞和骨髓细胞均不表达癌-睾丸抗原，但在髓性白血病细胞中可以有不同程度及不同种CTA的表达。研究结果显示：经siRNA干扰后，K562细胞中DNMT1、DNMT3a和DNMT3b的表达量均明显降低，癌-睾丸抗原CT10的启动子区序列发生了去甲基化，细胞出现癌-睾丸抗原CT10、PRAME和CT9的阳性表达。认为：干扰DNMT可使部分癌-睾丸抗原基因的启动子区发生去甲基化，从而导致相应的癌-睾丸抗原分子的再表达或表达增加。这有利于机体免疫细胞对肿瘤的识别，有利于诱导GVL等抗白血病现象的发生。朱雪姣等[8]在LipofectamineTM 2000介导下，将以miRNA-21为靶标的反义核酸(AMO-miR-21)转染K562细胞，对AMO-miR-21转染与阿糖胞苷(Ara-C)的药物敏感性以及与miRNA-21的靶基因Pdcd4的关系进行研究，Pdcd4是一种抑癌基因，在多种肿瘤细胞中低表达，与肿瘤增殖、凋亡、转移和侵袭等相关[9]。实验结果显示：Ara-C与AMO-miR-21联合使用后，药物敏感性提高到单用Ara-C的2.3倍，细胞凋亡明显增加，AMO-miR-21显著抑制K562细胞中miRNA-21的表达水平，同时Pdcd4的表达明显增加。认为：AMO-miR-21可通过靶向抑制miRNA-21提高K562细胞对Ara-C的敏感性，同时miRNA-21参与对Pdcd4的调控，促进细胞凋亡。吴燕等[10]将携带有JTV1基因的pcDNA3·1-JTV1载体转染人K562细胞，观察上调JTV1基因的表达对人白血病K562细胞系增殖与凋亡的影响。JTV1基因具有促进肿瘤细胞凋亡的作用，同时是致癌基因C-myc的负性调控因子。实验结果显示：上调JTV1基因表达后K562细胞的增殖能力明显降低。G期细胞比例明显升高，Bax基因的mRNA水平和蛋白水平明显上升，而Bcl-2基因和C-myc基因的mRNA水平和蛋白水平则明显下调。认为：JTV1基因的过表达可诱导K562肿瘤细胞凋亡，与上调Bax蛋白表达及下调Bcl-2蛋白表达相关，并可能通过抑制C-myc基因的表达促使K562细胞凋亡。
, 百拇医药
2.通过下调相关原癌基因表达，抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡等途径，发挥抗肿瘤作用。刘媛媛等[11]对Apolloon反义寡核苷酸的转录对K562细胞增殖和凋亡的影响进行了研究。Apollon的BIR序列是其抑制caspase活性、抗凋亡的重要结构。Apollon特有的结构域UBC能够加强Apollon的抗凋亡作用。研究者以脂质体作为载体，将Apollon反义寡核苷酸和Apollon错义寡核苷酸分别通过脂质体导入白血病细胞株K562，通过流式细胞仪的检测，结果表明Apollon反义寡核苷酸可有效抑制K562细胞的增殖、促进K562细胞凋亡，Apollon错义寡核苷酸则无明显作用，表明应用反义寡核苷酸技术封闭Apollon的表达可明显诱导白血病细胞凋亡，抑制肿瘤细胞增殖。杨玉枝等[12]的研究显示manumycin能够下调K562细胞中survivin蛋白的表达，从而可能起到抑制细胞的增殖的作用。manumycin是法尼酰基转移酶的特异性抑制剂，可与FPP竞争性结合法尼酰基转移酶，从而致Ras蛋白缺乏生物转化活性，干扰细胞膜上Ras蛋白的功能，阻断肿瘤细胞生长的信号通路，启动细胞凋亡通路，干扰Ras基因的表达。, 百拇医药(高华 童芸生)
[关键词]：慢性粒细胞白血病；过继免疫治疗；基因治疗；K562细胞
慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia， CML)是一种造血干细胞的恶性克隆增殖性疾病。目前证实唯一可以治愈CML的手段是进行骨髓或外周血干细胞移植，但移植风险较大，供体缺乏，治愈率偏低，因此寻找新的治疗方法成为了目前的研究热点。而肿瘤细胞的生物治疗是以分子生物学、免疫学等前沿科学为基础，通过调节或增强机体原本固有的内在防御机制，达到抑制或消除恶性肿瘤的目的，主要包括分子靶向治疗、免疫治疗、基因治疗等。下面将就CML的发病机制，CML的基因治疗和免疫治疗的基础研究进展等进行总结和回顾。
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一、CML的发病的分子机制
慢粒表现为Ph染色体t (9； 22) (q34； q11) 阳性的细胞遗传学特征，Ph染色体由位于第9号染色体的c-abl原癌基因与第22号染色体bcr基因相互易位形成表达P210bcr-abl融合蛋白的bcr-abl融合基因。P210bcr-abl融合蛋白具有异常活跃的酪氨酸激酶活性(PTK)，导致造血细胞过度增殖，减少细胞对骨髓基质的黏附性，破坏造血细胞、基质细胞与细胞内粘附分子介导的膜信号的相互作用，导致细胞凋亡障碍。该融合蛋白上包含位于abl区的酪氨酸激酶结构域、SHZ和SH3结构域、核定位信号区、DNA结合区和肌动蛋白结合区，位于bcr区的卷曲螺旋结构域、PH结构域、丝/苏氨酸激酶结构域和第177位酪氨酸，这些功能结构域通过衔接蛋白分子，如GRB-2、SHC、CRKL、CBL等相互作用，可激活Ras-Raf-MAPK、STAT-Bcl-XL、PI3K-AKT、NFκB等多条信号转导通路，促进抗凋亡蛋白Bcl-XL的表达，抑制Bad、Bax、Bak、Bim、Bid等促凋亡蛋白的活性，维持线粒体结构稳定，抑制线粒体释放CytC、AIF、EndoG、Smac/Diablo等促凋亡蛋白，阻止Caspase-3的活化和DNA片段化，抑制细胞凋亡[1-6]。
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二、 CML基因治疗的实验研究
基因的治疗方式可以表现在以下几个方面：
1.通过基因转染使肿瘤细胞的某种抗原标志过度表达，从而增加机体免疫系统的免疫识别，从而抗肿瘤作用。梁伟等[7]采用针对DNMT家族不同成员的siRNA转染K562细胞， 探讨了抑制甲基转移酶(DNMT)对K562细胞中癌-睾丸抗原(cancer-testis antigen， CTA)表达的影响。通常正常人的外周血细胞和骨髓细胞均不表达癌-睾丸抗原，但在髓性白血病细胞中可以有不同程度及不同种CTA的表达。研究结果显示：经siRNA干扰后，K562细胞中DNMT1、DNMT3a和DNMT3b的表达量均明显降低，癌-睾丸抗原CT10的启动子区序列发生了去甲基化，细胞出现癌-睾丸抗原CT10、PRAME和CT9的阳性表达。认为：干扰DNMT可使部分癌-睾丸抗原基因的启动子区发生去甲基化，从而导致相应的癌-睾丸抗原分子的再表达或表达增加。这有利于机体免疫细胞对肿瘤的识别，有利于诱导GVL等抗白血病现象的发生。朱雪姣等[8]在LipofectamineTM 2000介导下，将以miRNA-21为靶标的反义核酸(AMO-miR-21)转染K562细胞，对AMO-miR-21转染与阿糖胞苷(Ara-C)的药物敏感性以及与miRNA-21的靶基因Pdcd4的关系进行研究，Pdcd4是一种抑癌基因，在多种肿瘤细胞中低表达，与肿瘤增殖、凋亡、转移和侵袭等相关[9]。实验结果显示：Ara-C与AMO-miR-21联合使用后，药物敏感性提高到单用Ara-C的2.3倍，细胞凋亡明显增加，AMO-miR-21显著抑制K562细胞中miRNA-21的表达水平，同时Pdcd4的表达明显增加。认为：AMO-miR-21可通过靶向抑制miRNA-21提高K562细胞对Ara-C的敏感性，同时miRNA-21参与对Pdcd4的调控，促进细胞凋亡。吴燕等[10]将携带有JTV1基因的pcDNA3·1-JTV1载体转染人K562细胞，观察上调JTV1基因的表达对人白血病K562细胞系增殖与凋亡的影响。JTV1基因具有促进肿瘤细胞凋亡的作用，同时是致癌基因C-myc的负性调控因子。实验结果显示：上调JTV1基因表达后K562细胞的增殖能力明显降低。G期细胞比例明显升高，Bax基因的mRNA水平和蛋白水平明显上升，而Bcl-2基因和C-myc基因的mRNA水平和蛋白水平则明显下调。认为：JTV1基因的过表达可诱导K562肿瘤细胞凋亡，与上调Bax蛋白表达及下调Bcl-2蛋白表达相关，并可能通过抑制C-myc基因的表达促使K562细胞凋亡。
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2.通过下调相关原癌基因表达，抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡等途径，发挥抗肿瘤作用。刘媛媛等[11]对Apolloon反义寡核苷酸的转录对K562细胞增殖和凋亡的影响进行了研究。Apollon的BIR序列是其抑制caspase活性、抗凋亡的重要结构。Apollon特有的结构域UBC能够加强Apollon的抗凋亡作用。研究者以脂质体作为载体，将Apollon反义寡核苷酸和Apollon错义寡核苷酸分别通过脂质体导入白血病细胞株K562，通过流式细胞仪的检测，结果表明Apollon反义寡核苷酸可有效抑制K562细胞的增殖、促进K562细胞凋亡，Apollon错义寡核苷酸则无明显作用，表明应用反义寡核苷酸技术封闭Apollon的表达可明显诱导白血病细胞凋亡，抑制肿瘤细胞增殖。杨玉枝等[12]的研究显示manumycin能够下调K562细胞中survivin蛋白的表达，从而可能起到抑制细胞的增殖的作用。manumycin是法尼酰基转移酶的特异性抑制剂，可与FPP竞争性结合法尼酰基转移酶，从而致Ras蛋白缺乏生物转化活性，干扰细胞膜上Ras蛋白的功能，阻断肿瘤细胞生长的信号通路，启动细胞凋亡通路，干扰Ras基因的表达。, 百拇医药(高华 童芸生)