李虎 李儒军 曹宸喜 王白成,2 林剑浩 陶可,3**

    (1.北京大学人民医院骨关节科关节炎诊疗中心，北京100044；2.北京大学医学部，北京100191；3.德国洪堡医学院实验骨科研究所，萨尔D-66424)

    强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis,AS)是一种与炎症紧密相关的慢性进行性结缔组织疾病，以往研究证实，肌腱附着点异常骨化是其病变基础，成纤维细胞在致炎性因子作用下的成骨转化在AS病理性骨化病程中起重要作用[1-4]。

    已有研究显示，成纤维细胞经过连续的二维传代培养后，细胞间由于缺乏有效的信息联络、缺乏细胞外基质的力学刺激和空间支撑及细胞生长的常规培养瓶硬度明显高于细胞外基质等原因而导致细胞出现明显“去分化”现象，细胞形态及细胞功能发生明显变化，可观察到细胞极性显著增多、细胞增殖与分泌等能力降低。因而，传统的二维培养条件不能满足重现细胞在体的真实生存环境[5-11]。为了解决以上问题，本研究拟通过构建和比较AS韧带组织体外原位(in situ)、AS韧带成纤维细胞二维体外(in vitro)及三维水凝胶体外(in vitro)培养模型，并用腺病毒转染修饰以上3种模型，旨在探索更适合的模拟AS韧带组织体内生存状态的体外培养模型，为AS发病机制及基因治疗的深入研究提供最佳的模型选择。

    1 材料与方法

    1.1 主要材料

    DMEM培养液、Opti-MEM?、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA、PBS等试剂均购于Gibco公司，人胚胎肾293T细胞、重组5型腺病毒-半乳糖苷酶基因(rAd5-lacZ)等为本实验室保有，Ⅱ型胶原酶、HEPES(Sigma公司)，限制性内切酶Xba1、PacⅠ、BamH1和EcoRⅠ等(Rothe公司)，X-gal染色试剂盒(Rothe公司)，IL-6和TNF-α的ELISA试剂盒(RD公司)，Hoechst 33258、兔抗人vimentin抗体和兔抗人CD68多克隆抗体(Abcam公司)，小鼠抗人β-gal抗体和Rhodamine标记的羊抗兔荧光二抗(Sigma公司)，HE染液(Rothe公司)，酶标仪(Bio-Rad公司)，激光共聚焦显微镜(Confocal，Olympus公司)。

    1.2 髋关节韧带组织的获取

    本实验所需AS人髋关节韧带组织取自2014年9月至2016年9月北京大学人民医院骨关节科拟行髋关节置换的4例重度AS(髋关节强直)患者。所有患者均为男性 ......