陈科 吕小华 林健静 孙军营 袁正彬 周辉 叶健文 李中杰

    (1.深圳市人民医院暨南大学第二临床医学院南方科技大学第一附属医院脊柱外科，广东深圳 518020；2.广东医科大学药学院，广东湛江 524023；3.北京大学深圳医院骨科，广东深圳 518036)

    椎间盘退变引起的下腰痛在人群中的发病率很高，已成为排名第一的职业性疾病。下腰痛是导致老年人瘫痪的主要原因，严重影响老年人的生活质量，给患者及家属带来沉重的经济负担[1]。但是，有关椎间盘退变的机制仍未完全明确。越来越多的证据表明软骨终板退变是椎间盘退变的始动因素[2]。自噬是真核生物细胞一种高度保守自我吞噬的过程。近年来，有证据显示自噬在椎间盘退变过程中起重要作用[3]。亦有证据表明自噬还参与了椎间盘髓核细胞和关节软骨细胞的代谢过程，从而在椎间盘退变和关节软骨退变中发挥积极作用[4,5]。本研究拟探讨自噬在椎间盘软骨终板细胞代谢中的作用，以进一步揭示椎间盘退变的病理机制。

    1 材料与方法

    1.1 实验动物和主要试剂

    2周龄雄性SD大鼠购于广东省医学实验动物中心[实验动物许可证编号：SYXK(粤)2015-0106]，每笼5 只，恒温[(23±2)°C]、恒湿[(50±5)%]、每12 h 光暗循环的条件下适应性饲养2 周后用于后续的原代细胞提取实验。

    细胞培养相关试剂购自美国Gibco 公司；重组大鼠肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α，50 ng/ml，常用于模拟椎间盘退变和/或关节退变炎性细胞所处的环境)购自美国Peprotech公司，巴弗洛霉素(baflomycin A1，Baf，一种常用的自噬抑制剂)、聚集蛋白聚糖(aggrecan)抗体和Ⅱ型胶原酶购自美国Sigma Aldrich公司；tublin抗体购自碧云天生物技术研究所；β-actin 抗体购自美国Cell Signaling Technology 公司，Ⅱ型胶原纤维α1(collagen type Ⅱalpha 1，COL2A1)抗体购自英国ABcam 公司；TRIzol RNA 抽提试剂盒购自美国Invitrogen 公司；RT-PCR 试剂盒和实时PCR 试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司；mRNA 引物委托英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。

    1.2 大鼠原代腰椎间盘软骨终板细胞的提取

    通过颈椎脱臼法将4 周龄的雄性SD 大鼠处死，取其腰椎间盘，然后在解剖显微镜下放大4倍 ......