陈祖祥 葛彦志 范梦强 严莉 严波 单乐天,3 童培建*

    (1.浙江中医药大学附属第一医院骨伤科，杭州 310053；2.浙江中医药大学第一临床医学院，杭州 310053；3.杭州市第九人民医院骨科，杭州 311225)

    人脐带间充质干细胞(human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells,huc-MSCs)可促进受损组织再生[1]，近年来已成为再生医学中极具吸引力的治疗工具。但是研究发现只有少量的移植细胞能够到达靶组织且早期凋亡率极高[2-4]。调髓中药是治疗髓病的主要药物，且多数以补益肝肾为主[5]。有多项研究表明调髓中药可以调控MSCs的增殖活力与分化潜力[6,7]。有研究通过对历代治髓方剂中的调髓中药进行频次统计，将调髓中药分为不同频次[5]。本研究拟比较不同频次调髓中药对huc-MSCs的作用。

    1 材料与方法

    1.1 主要材料与试剂

    α-MEM 培养基购自美国Gibco 公司，胰蛋白酶(0.25%)购自美国Thermo Fisher 公司，TRIzol 试剂、逆转录试剂盒购于日本Takara 公司，2×SYBR购于美国BImake 公司，胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)购自中国CellMax 公司，CCK-8试剂盒购于美国BImake 公司，细胞培养板购自德国Eppendorf 公司，Transwell 小室购自美国Corning 公司，肉桂、肉苁蓉、当归、川芎、白术与何首乌配方颗粒购自中国华润三九公司。

    1.2 Huc-MSCs的分离培养与鉴定

    本研究经杭州市第九人民医院伦理委员会审批。人脐带组织取自杭州市第九人民医院，经产妇知情同意后，采集产妇产后废弃的脐带组织，4 h内处理，脐带切成<2 cm3体积，用磷酸盐缓冲盐水(phosphate buffer saline,PBS)洗涤3次。去除表皮组织和血管内皮后，将组织浸入含10%FBS的α-MEM培养基中，在37℃和5%二氧化碳下孵育。培养基每2 d或3 d更换一次。将分离的细胞作为huc-MSCs收集并重悬于含10%FBS的α-MEM培养基中，在细胞融合后进行传代。取第二代huc-MSCs，用PBS重悬细胞，密度为1×106/ml，并分别与CD34、CD73、CD90、CD105等抗体一起孵育。在室温下孵育30 min后，将每个细胞悬浮液以2000 r/min(r=14 cm)离心5 min。取出上清液 ......