刘川川，刘辉琦，曹学锋，刘 杰，吴 穹，王生兰

    (青海大学医学院，青海，西宁 810001)

    慢病毒介导RNA干扰沉默OPN基因抑制低氧引起的SD大鼠肺动脉血管平滑肌细胞增殖※

    刘川川，刘辉琦，曹学锋，刘 杰，吴 穹，王生兰*

    (青海大学医学院，青海，西宁 810001)

    目的 观察慢病毒介导RNA干扰沉默骨桥蛋白(Osteopontin，OPN)基因对低氧刺激下SD大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖的影响。方法 SD大鼠肺动脉平滑肌细胞分为四组：常氧对照组、低氧对照组、低氧+空病毒组、低氧+ OPN沉默组，分别采用MTT法检测各组细胞的增殖能力，实时荧光定量法检测各组细胞OPN mRNA的表达情况，Western Blotting法检测各组细胞OPN蛋白表达水平。结果 2%低氧环境培养PASMCs细胞48 h，可使OPN的mRNA和蛋白表达量较常氧对照组增高，细胞增殖能力增强，差异有显著性(P1 材料与方法

    1.1 实验动物与试剂选择

    SPF级雄性SD大鼠[约180g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物合格证号：SCXK(京)2012-0001，NO.11400700149469]。

    OPN shRNA试剂(广州赛业生物科技有限公司)；Trizol(Thermo Fisher Scientific公司)；qPCR试剂盒(takara公司)；引物[生工生物工程(上海)股份有限公司合成]；α-SMA抗体(Sigma公司)；DMEM/F12培养基、胎牛血清(Gibco公司)；OPN一抗(Abcam)；二抗(北京中杉金桥)；二甲基亚砜、RIPA、十二烷基磺酸钠、四甲基乙二胺、30%丙烯酰胺(北京索莱宝公司)。

    1.2 组织块贴壁法培养PASMCs及鉴定

    大鼠用10%水合氯醛行腹腔注射麻醉(0.2mL/kg)，75%乙醇浸泡10 s消毒后在超净台内迅速取出心肺组织，放入盛有4 ℃预冷PBS缓冲液的培养皿中，剔除心脏，沿肺动脉主干分离肺动脉，保留3～4级肺动脉。去除内外膜后将平滑肌剪成约1×1×1 mm大小的组织块，放入含20%FBS+DMEM/F12完全培养基中浸润后平铺于培养瓶中，培养瓶底部加入3 mL完全培养基，培养箱(37℃，5% CO2)中直立培养3 h后平放培养[9]。用α-SMA免疫组化法(1：100)鉴定。原代培养3～7代的细胞用于实验。

    1.3 细胞转染及有效转染病毒筛选

    生长良好的细胞传代于6孔板，待细胞达到30%～50%融合时转染(干扰序列见表1) ......