陈 筠，李志艳，赵 翀，刘 静，张 欣，朱德锐*

    (1.青海大学附属医院 口腔内科 西宁 810001；2.青海大学医学院 基础医学研究中心 810016)

    目前利用高通量测序技术(High throughput sequencing)开展微生物多样性检测、宏基因组学和微生物代谢组学方法来做口腔致病微生物的组成差异、种群结构研究，是国内外研究的热点[1-3]。

    研究者通过对海拔2 500 m以上的2 400名世居者及移居者进行牙周病学普查，发现土族移居者牙周病发病率高达98.7%，高于其他民族[4-6]。研究显示，高原地区(海拔4500m)的居民口腔疾病发病率及病程进展速度显著高于平原地区，牙周病的高发可能与其特殊的致病微生物的多样性和组成有关。然而针对高原地区牙周病的致病微生物的研究报道相对较少，且结论不一。因此本研究以青海土族人群为研究对象，采用16S rRNA基因高通量测序技术初步探究青海土族牙周病患者口腔可疑致病微生物的组成差异和种群结构，为后期牙周病的预防、诊断与治疗提供依据。

    1 材料与方法

    1.1 研究对象选取和唾液采集

    选取青海省互助土族自治县威远镇小庄村的土族居民牙周病样本10例。根据第三次全国口腔流行病学调查标准[7]收集慢性牙周炎患者样本，牙周袋深度(PD)≥4 mm或附着丧失量(AL)≥2 mm，所有的选取对象无侵袭性牙周炎、口腔粘膜病、溃烂或智齿冠周炎等干扰本研究结果的疾病。就诊前6个月内未做口腔治疗。采样前先嘱受试者轻漱口，去除口腔中的食物残渣，停止吞咽1 min后让唾液(1.5mL)自行流入5 mL无菌EP管中，标记样本为T1～T10，冰浴运输，2 h内检测完毕。

    1.2 基因组DNA的提取及质量控制

    样本于0.22 μm细菌滤膜上进行真空抽滤，将滤膜剪碎放入DNA试剂盒(QI Aamp Fast DNA Stool Mini Kit)，参照试剂盒步骤提取基因组DNA，用2.0%琼脂糖凝胶电泳分析环境样本DNA完整性。DNA质量纯度检测分析采用微量检测仪Microplate Reader(USA，MD公司)，合格的总DNA样品保存于-80 ℃冰箱。

    1.3 PCR扩增和测序 ......