石 晴，朱德锐

    (青海大学医学院 基础医学研究中心 西宁 810016)

    四氢嘧啶[Ectoine：(4S)-2-methyl-1，4，5，6-tetrahydropyrimidine-4-carboxylic acid]是一类嗜盐或耐盐菌胞内合成的主要相容溶质，是用于抵抗高盐环境的一种重要物质[1]。其结构属氨基酸环化衍生物或部分氢化嘧啶衍生物[2]，具有分子手性，化学方法难以合成[3]。在生化特性方面，Ectoine具有惰性、胞内高耐受性、热稳定性和水溶性等特点[2]，影响细胞在逆境环境中的渗透压调节功能，可提高细胞在高盐、干旱和低温等恶劣环境中的适应性。Ectoine作为微生物重要的次级代谢产物，已广泛应用于生物医学领域[4-7]。

    近年来，Ectoine的生物合成途径从基因水平、酶水平和调控水平等方面已有较为深入的研究。用ectA、ectB和ectC3个基因分别编码的L-2，4-二氨基丁酸乙酰转移酶(Ect A)、L-2，4-二氨基丁酸转氨酶(Ect B)和Ectoine合成酶(Ect C)调控Ectoine的生物合成[8]：首先，以L-天冬氨酸-β半醛(ASA)为底物在Ect B催化作用下生成L-2，4-二氨基丁酸(DABA)；其次，Ect A将DABA乙酰化生成N-乙酰-L-2，4-二氨基丁酸(ADABA)；最后，将ADABA催化生成四氢嘧啶。基于此，克隆及异源表达Ectoine合成基因簇及其上游调控序列，用于阐明在盐激条件下何种调节蛋白或因子参与Ectoine合成基因簇ectABC操纵子的启动应答的分子机制。本研究以Halomonassp.QHL1为模式菌株，克隆ectABC基因簇及其上游调控序列，并对其在E.coilBL21中的蛋白表达及耐盐能力进行检测。

    1 材料与方法

    1.1 实验材料

    Halomonassp.QHL1菌株分离自青海湖水体；菌株E.coilDH5α和E.coilBL21(DE3)由青海大学医学院基础医学研究中心提供；细菌基因组DNA提取试剂盒、质粒小提试剂盒(离心柱)和GeneGreen核酸染料购自北京天根生化科技有限公司；克隆载体pMD18-T、表达载体pColdⅠDNA、T4 DNA连接酶和限制性内切酶购自大连TaKaRa公司；DL 5000 Maker购自广东东盛生物科技有限公司；AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒购自杭州爱思进生物技术有限公司 ......