米国霞，李晓娜，傅振幸，杨全余，李生花*

    (1.青海大学医学院基础医学部，青海 西宁 810016，中国；2.加州大学圣地亚哥分校医学院，加利福尼亚 拉荷亚 92037，美国；3.青海大学高原医学研究中心，青海 西宁 810001，中国)

    随着对自噬研究的深入，研究人员发现自噬在缺氧诱导的细胞损伤中起着双重作用。某种程度的自噬激活对变性蛋白和老化细胞器的降解有好处，并且提供合成蛋白所需的物质；但是过度激活的自噬又导致神经元自消化和凋亡，进一步加重缺氧细胞的损伤[1]。

    微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)是自噬体膜标志性蛋白，自噬形成时，胞质型 LC3Ⅰ会酶解掉一小段多肽，转变为膜型LC3-Ⅱ，因此，LC3-Ⅱ/Ⅰ比值的大小可反映自噬水平的高低[2]。细胞自噬受体蛋白p62作为泛素化底物和LC3转化之间的衔接蛋白，其蛋白表达水平的高低与自噬活性成反比，是检测自噬活性的一个辅助指标[3]。

    缺氧可抑制低氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1，HIF-1α)亚基降解、可调控蛋白激酶Cε(protein kinase c epsilon，PKCε)水平[4]。脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)被认为是海马中主要的长时程增强(Long-term potentiation，LTP)调节剂，在神经元的分化、生存和突触的形成中起重要作用[5]，低氧情况下可受PKCε调控[4]。

    激活或抑制自噬活动有望成为人类治疗疾病的新方法，包括神经性疾病。目前尚缺乏一个可调节自噬的药物[6]。藏药四味黄芪散具有脑神经保护作用，其作用机制不明。本研究将探讨藏药四味黄芪散是否通过对海马神经元自噬活动的调控发挥脑神经保护作用。

    1 材料与方法

    1.1 仪器与试剂

    低压低氧氧舱购自中航风雷公司；电泳仪、电泳槽、ECL发光液购自Bio-Rad公司；RIPA、PMSF、4%多聚甲醛(815B0215)、2.5%电镜固定液(P1126)均购自索莱宝公司；转膜液、电泳液购自碧云天公司；蛋白酶抑制剂购自罗氏公司；BCA蛋白定量试剂盒、Marker购自Thermo公司；ELISA试剂盒(E-EL-R0513c)购自武汉伊莱瑞特生物公司；PVDF膜购自Mil-lipore公司；LC3(BST17924827)、P62(BST17464385)、PKCε(BST17775249)、BDNF(BST17304113)均购自博士德生物公司；β-actin(20536-1-AP)购自武汉三鹰公司；LC3(ab48394)、HRP(ab6721)、Cy2(ab6940)、含DAPI的封固剂(ab104139)均购自Abcam公司 ......