王 蕾，杨宝良，魏 威，周 培，刘海生，李润乐，汤 锋*

    (1.青海大学高原医学研究中心，青海省高原医学应用基础重点实验室，青海 西宁 810001；2.青海省红十字医院，青海 西宁 810001；3.青海大学基础医学部，青海 西宁 810001；4.青海大学研究生院，青海 西宁 810001)

    亮氨酸氨基肽酶是一种金属肽酶，它在微生物、哺乳动物和植物中广泛存在并具有特定的作用[1]；M17氨基肽酶家族(M17-LAP)被证实它在许多寄生虫感染中起到了保护宿主的作用。在寄生虫感染过程中，寄生虫来源的蛋白酶是影响寄生虫生理功能和致病性的关键因素，如蛋白质分解代谢、营养物质获取和寄生虫在宿主体内的迁移、组织入侵、免疫逃避及在宿主体内的存活等[2]。这些蛋白酶已被开发为控制各种寄生虫感染的靶点药物、候选疫苗和血清诊断标志物。因此本研究主要通过构建pCzn1-LAP质粒表达蛋白，通过分离纯化获取目的蛋白为后续多房棘球蚴LAP行优势抗原表位鉴定，及评价LAP对多房棘球蚴感染是否具有保护作用奠定基础。行酶学作用条件分析可为研制抗虫药物和疫苗提供有价值的应用信息。

    1.材料与方法

    1.1 主要试剂

    pCzn1质粒(钟鼎生物公司)，限制性内切酶(TaKaRa公司)，蛋白质Marker(Thermo公司)，IPTG(Sigma公司)，质粒小提试剂盒(AXYGEN公司)，大肠杆菌BL-21感受态细胞(钟鼎生物公司)，氨苄青霉素钠(Solarbio公司)，MD34透析袋(Solarbio公司)，Ni2+IDA亲和层析柱(Novagen公司)。亮氨酸对硝基苯胺(Sigma公司)，甘氨酸(Amresco公司)。

    氯化物为国产分析纯。

    1.2 方法

    1.2.1 pCzn1-LAP质粒构建

    参照文献方法实验[3]。LAP蛋白的氨基酸序列通过NCBI-GenBank网站获取，序列号为CDS36608.1，含有1796个碱基，编码519个氨基酸，蛋白质理论分子量大小为57 KD。利用OptimumTMCodon软件进行密码子优化，获得最优的碱基序列(适合蛋白质原核表达)[4]。采用基于PCR精确合成的方法，设计全长拼接引物合成LAP基因，添加两个酶切位点，并在引物的两端分别设计了保护性碱基，连入载体pCzn1。将获得的重组质粒pCzn1-LAP转入BL-21克隆菌株 ......