王迦乐,黄登亮,张耀刚,姜 军

    (1.青海大学附属医院中心实验室,西宁 810001;2.青海大学研究生院,西宁 810016;3.青海大学附属医院肿瘤科,西宁 810001)

    乳酸是肿瘤重要的代谢产物,低氧又是肿瘤的普遍特征,两者之间的相互作用是否会对肿瘤细胞线粒体功能产生影响?本研究通过相关研究初步探讨乳酸对人非小细胞肺癌细胞线粒体自噬的影响。

    1 材料与方法

    1.1 材料

    1.1.1 细胞株

    人正常肺上皮细胞(BEAS-2B)、人非小细胞肺癌细胞(A549)购自中国科学院细胞库。

    1.1.2 试剂与仪器

    乳酸(Sigma-Aldrich公司,L6402型),乳酸检测试剂盒(Solarbio公司,A019-2型),二甲基亚砜DMSO(Solarbio公司,D8370型),胎牛血清(Biological Industries公司,04-001-1ACS型),0.1%胰酶(Gibco公司,27250018型),1640培养基(Gibco公司,23400-021型),FastStart Universal SYBR GreenMaster(Roche公司,04913914001型),MitoTracker?Deep Red FM线粒体深红色荧光探针(Thermor Frsher Scientific公司,M2247型),CytoPainter LysoView Blue溶酶体染料(abcam公司,ab176825型),LC3B抗体(abcam公司,ab192890型),β-Actin 抗体(boster公司,BMO627型),TOM20抗体(abcam公司,ab56783型),HSP60抗体(Cell Signaling Technology公司,12165S型)。细胞成像微孔板检测系统(BioTek公司,Cytation5型),实时荧光定量PCR仪(ROCHE公司,ROCHE Light Cycler 480Ⅱ型),超微量核酸蛋白浓度测定仪(Nanodrop公司,Nanodrop 2000C型)。

    1.2 方法

    1.2.1 细胞培养与分组

    将BEAS-2B、A549细胞培养于含10%胎牛血清的1640培养基中,置细胞培养箱(5%CO2,37℃,95%湿度)培养,2～3 d更换培养基,细胞汇合度达到80%左右时用0.1%胰酶消化传代,取对数生长期的细胞接种于12孔板或6孔板。将BEAS-2B、A549细胞分为常氧组(21%O2,5%CO2,37℃)、低氧组(1%O2,5%CO2,37℃) ......