刘文婧,吕慧玲,王顺娟,冯 琳,汤 锋,李润乐§,胥 瑾*

    (1.青海大学医学部,西宁 810001;2.青海省藏医院,西宁 810007;3.青海省人民医院,西宁 810007;4.青海大学高原医学研究中心,西宁 810001)

    课题组前期利用羊驼天然纳米抗体文库,筛选得到了针对幽门螺旋杆菌(Helicobacterpylori,H.pylori)尿素酶B亚基(Urease-B)的高亲和力纳米抗体UreNb。本研究构建幽门螺旋杆菌尿素酶纳米抗体UreNb重组质粒,在大肠杆菌系统中通过诱导表达目的蛋白并予以纯化,再对表达产物及纯化产物进行鉴定。

    1 材料与方法

    1.1 材料

    1.1.1 主要试剂

    pET22b质粒、DH5α感受态细胞、Arctic-Express表达菌、BL-21(DE3)表达菌、Rosetta表达菌、pSumo-mut质粒均购自钟鼎生物公司。限制性内切酶购自TaKaRa公司,蛋白质Marker购自Thermo公司,IPTG购自Biotopped公司,氨苄青霉素钠、四环素、卡纳霉素购自Solarbio公司,0.22 μm无菌滤器和透析袋购自Ruitaibi公司,Ni-IDA亲和层析柱购自GenScript公司,4×蛋白上样缓冲液购自Solarbio公司。

    1.1.2 主要仪器

    多聚酶链式反应仪购自艾本德公司,凝胶成像分析系统购自法玛西亚公司,酶标分析仪购自美谷分子公司,蛋白纯化仪购自上海嘉鹏有限公司,低温高速离心机购自德国西格玛公司。

    1.2 实验方法

    1.2.1 UreNb在质粒pET22b中的构建及表达鉴定

    在前期研究中经筛选获得了针对Urease-B纳米抗体UreNb的氨基酸序列,经翻译后得到的核苷酸序列采用密码子优化后用于全基因合成。在T1连接酶体系下经过酶切(NcoI/XhoI)后连接(4℃,过夜),将UreNb核苷酸序列克隆至质粒pET22b后转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞,获得重组质粒pET22b-UreNb。从培养的阳性菌落挑选、提取质粒,通过双酶切(MluI/XhoI)法鉴定克隆结果。pET22b-UreNb分别转化至表达菌株BL-21、Arctic Express、Rosetta,涂布于含有相应抗性的固体培养基上培养(37℃,过夜)后,挑取单克隆并进行扩大培养,而后分别吸取1 mL菌液加入到200 mL的LB培养基中扩增培养。三种表达菌同时加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl-β-D-thiogalactoside,IPTG ......