1.6 气管粘膜原代细胞CK19免疫荧光染色 (1)细胞盖玻片经PBS洗涤后用0.1tritonX-100PBS液室温孵育30min。

    (2)用10g/L BSA封闭10min后，将即用型兔抗鼠CK19抗体分别加到载有细胞的盖玻片上，4℃孵育过夜。

    (3)经PBS洗涤后加入FITC标记的抗兔IgG(稀释度为1：200)，37℃孵育60min。

    (4)PBS洗涤，用无荧光缓冲甘油封固后，直接在CLSM下观察并拍照。以PBS替代一抗作为阴性对照。

    1.7 激光共聚焦显微镜观察 以绿色荧光通道扫描观察。绿色荧光的激发波长为488nm，在530nm波长以上观察。用于图像采集的显微镜物镜为plan Neofluar 40×，数值孔径(NA)为1.3，图像存为512×512相素类型，扫描激发值选择3%。每张玻片选择细胞较为密集的区域，每高倍视野随机选取20个细胞，利用软件分析荧光强度。实验重复进行3次，以平均荧光强度作为该蛋白的相对表达量。

    1.8 数据记录及统计分析 计数数据采用卡方检验。

    2 结果

    2.1 烟雾吸入后不同时相点大鼠肺组织病理学改变 烟雾吸入后3d解剖并进行病理组织学检查，第2组20只动物肺组织病理改变均出现不同程度的肺泡上皮细胞坏死，肺泡腔内大量含棕黄色颗粒的巨噬细胞聚集，还有少量红细胞及水肿液 ......