(河南大学第一附属医院心内科,河南 开封 475000)

    急性心肌梗死是冠状动脉持续性缺血低氧引起的心肌坏死，当冠状动脉血运重建时可能诱发缺血/再灌注损伤[1-2]。如何减少缺血/再灌注造成的心肌细胞损伤一直以来是心血管疾病临床和基础研究的重点。蟾毒灵是一种从传统中药蟾酥中提取的中药单体，具有抗炎、镇痛、强心、抗肿瘤等多种临床功效[3-4]。有研究显示，蟾酥能够改善缺血心肌细胞的能量代谢，在一定浓度范围内呈浓度依赖性地抑制大鼠心肌细胞收缩，减轻心肌损伤，对心肌具有保护作用[5-6]。然而，蟾毒灵在心肌缺血/再灌注损伤中是否发挥作用的研究鲜有报道。因此，本实验通过体外构建低氧/复氧(H/R)心肌细胞损伤模型，观察蟾毒灵对H/R损伤心肌细胞的影响及机制，为利用蟾毒灵防治心肌H/R损伤提供实验依据。

    1 材料与方法

    1.1 实验材料

    大鼠心肌细胞株H9c2购自中国科学院上海生命科学学院细胞资源中心；蟾毒灵(纯度≥98%)购自烟台靶点药物研究有限公司；DMEM培养基、胎牛血清购自美国Gibco公司；CCK-8细胞活力检测试剂盒购自北京旷博生物技术有限公司；活性氧(ROS)、超氧化物歧化酶(SOD)及丙二醛(MDA)含量检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；Annexin Ⅴ-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒购自日本TaKaRa公司；Western blot检测所需试剂均购自上海碧云天生物技术研究所；剪切的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3和9(Cleaved Caspase-3，Cleaved Caspase-9)抗体购自美国Santa Cruz公司；β-actin抗体和辣根过氧化物酶标记的二抗购自美国CST公司。

    1.2 实验方法

    1.2.1H/R心肌细胞模型的构建 在含体积分数0.10胎牛血清的DMEM培养基中培养心肌细胞H9c2，放置在体积分数0.05 CO2、0.95空气、37 ℃恒温培养箱中培养。参照文献方法构建H/R心肌细胞模型[7]，待心肌细胞生长达60%左右融合时，除去旧培养液，加入不含血清的新鲜DMEM培养液，将心肌细胞放置在体积分数0.95 N2和0.05 CO2培养箱中低氧处理12 h ......