江卓,唐杰,刘彩林,于永敏,高岭

    (1 郑州市第六人民医院检验科,河南 郑州 450000； 2 郑州大学第一附属医院检验科)

    肝癌是世界范围内常见的恶性肿瘤，肝癌治疗虽取得明显进步，但病人生活质量仍然较差[1]。研究发现，肝癌恶性进展与基因差异表达有关，这些基因参与调控肝癌细胞的生物学行为，可成为肿瘤治疗的潜在分子靶点[2]。因此，研究影响肝癌进展的分子机制可为靶向治疗提供分子靶点。miRNA可影响肿瘤进展，认为调控miRNA表达可能是有效抑制肿瘤恶性发生发展的途径之一[3-4]。研究发现miR-1292-5p在胃癌中低表达，上调miR-1292-5p可抑制胃癌细胞恶性生长，表明miR-1292-5p可能是一种肿瘤抑制因子[5]。然而，miR-1292-5p在肝癌中作用及机制尚未见报道。Akt/PI3K信号通路与多种肿瘤进展有关，Akt/PI3K信号通路过度激活可影响肿瘤细胞的恶性表型[6-8]。本次实验首先探讨miR-1292-5p在肝癌细胞和正常肝细胞中的表达差异，然后首次研究上调miR-1292-5p对肝癌细胞增殖、自噬、周期和凋亡等影响，为靶向基因治疗肝癌提供可能方向。

    1 材料与方法

    1.1 实验材料

    肝癌HuH7、HCC9204和SNU-449细胞均购自广州赛库生物技术有限公司；正常肝L-02细胞购自通派(上海)生物科技有限公司；C-Caspase-3抗体、Beclin1抗体均购自Cell Signaling Technology；miRNA第一链cDNA合成试剂盒、SYBR Premix Ex Taq miRNA kit购自大连TAKARA；p-Akt抗体、p-PI3K抗体和Cyclin D1抗体购自美国BD公司；miR-1292-5p mimics、mimics control购自北京科忠智生物技术开发有限公司；ATG5抗体、PI3K抗体和P21抗体购自上海碧云天生物技术有限公司；Akt抗体购自美国Abcam。

    1.2 实验方法

    1.2.1实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测肝癌细胞中miR-1292-5p表达 在肝癌HuH7、HCC9204、SNU-449细胞和正常肝L-02细胞中添加Trizol试剂，分别提取各组细胞总RNA，以无RNA酶水将RNA溶解，以-20 ℃保存备用。以miRNA第一链cDNA合成试剂盒反转录，体系含有：10 μL的2×miRNA L-RT Solution mix、200 ng的miRNA、1.5 μL的miRNA L-RT Enzyme mix以及1 μL的Stem-loop primer ......