王琪玮,张敬东

    (辽宁省肿瘤医院消化内科二病区,辽宁 沈阳 110042)

    结直肠癌的发病率居我国恶性肿瘤的第2位,死亡率居第5位[1]。以西妥昔单抗为代表的抗细胞生长因子受体(EGFR)单抗,被广泛用于KRAS基因野生型转移性结直肠癌(mCRC)病人的转化[2-5]及姑息治疗中[6-7]。然而,西妥昔单抗与化疗联合的客观有效率仅为55%～65%,中位无进展生存期为10～11月,这意味着有近半数的病人未能获益,并且有效的病人多在1年内出现进展[6,8]。因此,探讨西妥昔单抗的原发及继发耐药机制并尝试进行逆转具有重要的基础及临床意义。除了研究较充分的耐药机制,如KRAS、NRAS、BRAF、PI3 K等基因突变导致下游通路的持续激活[9],近年来的研究显示,结直肠癌中EPHA2的过表达与肿瘤转移和更差的预后相关,且可能与西妥昔单抗的疗效相关[10-14]。EPHA2是促红细胞生成素产生肝细胞受体(EPH)家族的成员之一,目前关于EPHA2靶向治疗能否逆转西妥昔单抗的耐药尚无深入研究。本研究旨在明确CRC 病人西妥昔单抗治疗前后EPHA2的表达水平,并在原发及继发CRC 耐药细胞系中探索EPHA2抗体能否逆转西妥昔单抗的耐药。

    1 材料与方法

    1.1 实验材料

    1.1.1抗体与试剂 BCA 蛋白浓度检测试剂盒(由美国Thermo Fisher Scientific公司提供);β-actin抗体、EPHA2抗体、p EPHA2抗体(美国Sigma公司);RPMI 1640培养基(美国Hyclon公司);胎牛血清(BI公司);胰蛋白酶(杭州四季青生物工程材料有限公司);MTT 试剂(美国Sigma公司);山羊抗兔二抗(美国Abcam 公司),DS-8895a(日本Daiichi Sankyo公司)。

    1.1.2细胞系 人结直肠癌细胞系HCT116购自中国科学院上海细胞库,人结直肠癌细胞系HKH-2由日本国际医学中心研究所的SHIRASAWA 博士转赠。

    1.2 实验方法

    1.2.1细胞培养 使用含体积分数0.10胎牛血清的RPMI 1640 培养基分别对HKH-2 和HCT116细胞进行培养,每2～3 d传代1次,于37 ℃、含体积分数0.05的CO2培养箱中培养,实验时取对数生长期细胞 ......