何兆辉,王志谦,王国良,郑先杰,滕伟

    (河南大学第一附属医院心血管内科,河南开封 475000)

    心肌纤维化是心血管疾病终末期共同的生理病理过程[1]。心肌成纤维细胞(CFs)异常增殖和胶原蛋白合成增多是心肌纤维化的重要表现,研究影响CFs增殖和胶原蛋白合成的分子机制,寻找有效的干预靶点对心血管疾病的治疗具有重要意义。还原型烟酰胺腺嘌呤双核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶非吞噬细胞氧化酶4(NOX4)是NADPH NOX 家族成员,在成纤维细胞、内皮细胞和平滑肌细胞等中广泛表达,与肺、肾、肝和心脏等多种组织纤维化过程密切相关[2-3]。本研究通过观察转染NOX4小干扰RNA(siRNA)对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的CFs增殖和胶原蛋白的影响,揭示NOX4在心肌纤维化过程中的作用机制。

    1 材料与方法

    1.1 实验材料

    出生2 d雄性清洁级SD乳鼠(河南省实验动物中心)。AngⅡ(美国Sigma),胎牛血清和胰蛋白酶(美国Hyclone),青霉素-链霉素(青链霉)双抗和DMEM 培养基(美国Gibico公司),转染试剂LipofectineTM2000(美国Invitrogen公司),RIPA 裂解液和SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(碧云天生物技术研究所),CCK-8试剂盒(日本同仁化学研究所),ECL化学发光剂和BCA 蛋白浓度测定试剂盒(索莱宝生物公司),CollagenⅠ、CollagenⅢ抗体(武汉博士德生物公司),GAPDH、p38MAPK、p-p38MAPK 和NOX4抗体(美国CST 公司),HRP 标记山羊抗鼠IgG(天津三箭生物公司)。CO2培养箱、酶标仪和凝胶成像分析系统(美国Bio-Rad公司)。

    1.2 实验方法

    1.2.1 CFs分离与培养 无菌条件下取SD乳鼠的心肌组织并剪碎后,加入1.25 g/L 胰蛋白酶消化,收集上清液,加入含体积分数0.01青链霉双抗和体积分数0.10胎牛血清的DMEM 培养基,置于37℃含体积分数0.05 CO2培养箱中培养。根据CFs比心肌细胞贴壁速度快的特点采用差速贴壁法贴壁培养2 h。除去未贴壁的细胞,获得的贴壁的细胞多数为CFs,并采用波形蛋白免疫荧光法鉴定为CFs(纯度达98%) ......