张京,郑宪鑫,杨岚婷,王建勋

    (青岛大学医学部基础医学院,山东 青岛 266071)

    糖尿病心肌病是糖尿病病人高死亡率的因素之一[1]。研究表明，高糖血症是糖尿病心肌病发生的始动因素[2]，高糖血症能够促进活性氧(ROS)过度释放，进而通过诱导心肌细胞凋亡而引起糖尿病心肌损伤[3]。心肌细胞凋亡和糖尿病心肌病的发生存在密切关系[4-5]。但高糖诱导引起心肌细胞凋亡的具体分子机制尚不清楚。具有半胱天冬酶募集域的凋亡抑制因子(ARC)是一种在心脏和骨骼肌中高表达并具有高效抑制凋亡作用的内源性多功能蛋白[6-7]。ARC具有很强的心脏保护功能，而这种保护功能主要体现在其对凋亡性心肌细胞的抑制[8]。有研究结果显示，心肌细胞中ARC参与调控多种心血管疾病的发生发展，比如心肌梗死、心脏缺血再灌注损伤和心肌肥大[9-11]。还有研究显示，ARC在阿霉素诱导的心肌细胞凋亡过程中发挥着抑制作用[12]，在心脏缺血再灌注损伤诱导的心肌细胞程序性坏死中ARC也有强保护作用[13]。同时有研究显示，ARC可以抑制线粒体凋亡途径引起的细胞死亡[10]。P53在调节细胞死亡过程中起到重要作用。P53通过与死亡相关的蛋白相互作用或作为转录因子调控基因表达来促进细胞死亡[14]。有研究显示，P53可以促进线粒体呼吸导致的活性氧生成和脂质积累过多导致的糖尿病心脏功能障碍[15]；靶向抑制P53可以有效预防糖尿病心肌病[16]；P53可以结合ARC的启动子区域并在凋亡开始时在转录水平上降低其表达[17]。但P53是否可以通过调控ARC的表达调节糖尿病心肌病的发生发展有待研究。既往有研究发现，在糖尿病性心肌病模型中敲低ARC会引起心肌细胞焦亡，这表明ARC可以通过抑制高糖诱导的炎性因素来保护心脏[18]。但ARC是否可以通过抑制心肌细胞凋亡抑制糖尿病心肌病的发展尚不清楚。本文研究检测了ARC对高糖诱导的H9c2细胞凋亡的影响，并观察过表达ARC对ROS和线粒体膜电位的影响，进一步探讨ARC影响高糖诱导的H9c2细胞凋亡的机制。

    1 材料与方法

    1.1 实验材料

    大鼠心肌细胞(H9c2细胞)、人胚胎肾细胞293(HEK293细胞)为本实验室之前所有，在液氮中冻存；DMEM高糖培养液、胎牛血清和胰酶购自美国Gibico公司；RIPA裂解液购自上海雅酶生物科技有限公司；ARC抗体购自美国CST公司；p53抗体购自英国Abcam公司；链脲佐菌素(STZ)购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司；Tunel细胞凋亡检测试剂盒(FITC)购自上海翊圣生物科技有限公司；caspase3/7活性检测试剂盒以及线粒体膜电位检测试剂盒购自大连美仑生物技术有限公司；抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)购自上海碧云天生物技术有限公司；ROS检测试剂盒购自北京索莱宝生物技术有限公司；腺病毒ARC(Ad-ARC)、腺病毒h-半乳糖苷酶(Ad-β-gal)、腺病毒si-ARC(Ad-si-ARC)、腺病毒scr-ARC(Ad-scr-ARC)、腺病毒si-p53(Ad-si-p53)和腺病毒 scr-p53 (Ad-scr-p53)为本实验室之前合成[17] ......