刁玮琳,尹敏,李翠

    (青岛大学附属医院眼科,山东 青岛 266003)

    真菌性角膜炎是最严重的感染性角膜病之一,其发病率持续上升[1]。烟曲霉菌(AF)是角膜感染的主要真菌病原体,角膜上皮损伤是角膜炎的关键诱发因素[2]。真菌侵入角膜基质层时诱发的免疫反应导致进一步的组织损伤[3]。桃叶珊瑚苷(AU)存在于许多天然植物中[4],具有广泛的药理学特性,如抗炎、抗菌、抗氧化、神经保护以及抗纤维化等作用[5-9]。研究显示,AU能够降低干眼症小鼠白细胞介素-1β(IL-1β)和白细胞介素-8(IL-8)等炎症因子表达预防角膜上皮损伤[10],AU通过TOLL样受体4/髓样分化因子88/人核因子κB抑制蛋白α/核因子κB信号通路抑制脊髓损伤模型中的炎症,从而促进神经元功能恢复[11];AU通过抑制肌醇依赖酶1α/硫氧还蛋白互作蛋白信号通路缓解炎症反应,从而延缓2型糖尿病诱导的肝纤维化发展[12]。因此,AU具有抗炎潜力并且可能成为治疗真菌性角膜炎的药物。本研究探讨AU对AF诱导的真菌性角膜炎炎症反应的作用。

    1 材料和方法

    1.1 真菌制备

    AF标准菌株(菌株3.0772,中国微生物中心)于固体琼脂培养基中培养,振荡研磨后收集菌丝,以12 000 r/min离心15 min,用无菌PBS洗涤。将收集的活化菌丝用于动物实验;用体积分数0.70乙醇处理灭活菌丝,并将浓度调整为3×1011CFU/L用于细胞实验。

    1.2 细胞培养与刺激

    人角膜上皮细胞(HCECs)由中国福建厦门大学实验室提供。将HCECs接种于6孔板或者12孔板之中,在含有胎牛血清的F12细胞培养液中37 ℃培养,至细胞生长密度达到80%,将细胞分为DMSO组、AU组、AF+DMSO组、AF+AU组,其中DMSO组与AU组分别加入含有体积分数0.005 DMSO和20 mg/L AU的细胞培养液培养;AF+DMSO组与AF+AU组分别加入体积分数0.005 DMSO和20 mg/L的AU预处理2 h后,加入灭活菌丝。收集菌丝刺激8 h后的细胞进行RT-PCR,收集刺激24 h的细胞进行Western blot和ELISA检测。

    1.3 检测指标及方法

    1.3.1药物细胞毒性评估 将HCECs接种于96孔板中,分别加入含有不同浓度AU(5、10、20、40、80、160、320 mg/L)细胞培养液,37 ℃下培养24 h后,每孔加入10 μL CCK-8试剂(Solarbio,中国北京)后培养2 h,用酶标仪测定450 nm波长处吸光度值,以其评估各组细胞存活率 ......