王 泽，唐景峰

    (1.阳泉市第三人民医院，山西 阳泉 045000;2.武汉大学生命科学学院/病毒学国家重点实验室，湖北武汉 430072)

    乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)严重危害人类健康，是引起肝脏疾病的主要致病病毒之一[1，2]。全球约有20亿人感染过HBV，其中慢性HBV携带者有4亿人之多，每年造成的死亡人数约有100万。乙型肝炎病毒的发病机制主要是机体清除HBV而引发的细胞免疫病理改变，较早的研究显示在HBV感染过程中HBeAg的转阴预示病毒的清除和疾病的好转[3]。但近期研究发现乙肝病毒感染机体后，相当部分HBeAg转阴是为逃避免疫清除而发生的变异[4～6]。

    HBV DNA C区启动子(The basal core promoter，BCP)负责调控编码HBeAg和核心抗原的RNA的转录，BCP序列中的双突变1762(A→T)和1764(G→A)经常相伴出现，研究资料表明BCP双突变与爆发性肝炎和慢性化有关[7]。前C区1896位点也是最常见的变异位点之一，该位点G-A的替换，使编码色氨酸的密码子UGG变为终止密码子。1762/1764和1896的突变均可引起HBeAg不表达，逃避机体的免疫清除，故临床检测该基因变异对肝炎的治疗有重要意义。本实验采用错配扩增和荧光PCR结合的突变分析法(MAMA-PCR)检测基因突变[8～10]，每个位点含两对特异性引物(A和B)和1条特异性含荧光标记的Taqman探针，引物A对野生型和突变型序列都能正常扩增，而引物B为错配引物，对突变型序列能正常扩增，对野生型序列则不能扩增或扩增效率极低。对每个样本均分别用引物A和引物B在不同的PCR管内扩增，根据引物A和B两者扩增所得Ct值的差异即可判断位点突变的发生与否。

    图1 错配扩增荧光PCR原理Fig 1 The Principle of Mismatch Amplification and Fluorescent PCR

    本研究主要针对突变位点检测，对比金标准测序法和MAMA-PCR荧光法样本检测的差异，分析MAMA-PCR法检测样本的准确性，为临床HBV BCP区和前C区突变位点的检测提供新的检测方法。

    1 资料与方法

    1.1 一般资料 ......