高 丽 ，马叶华 ，何权敏 ，张 剑 ，刘 琪

    (1.遵义医学院附属口腔医院口腔内科，贵州遵义563003；2.江苏省宜兴市牙病防治所，江苏宜兴214200)

    牙周组织再生需要形成新附着，而新附着的形成是一个复杂的过程，它包括了牙周组织细胞和胞外基质在时间和空间上的协作[1]，涉及牙周组织细胞的迁移、附着及增殖；而新附着形成的首要条件是PDLFs在牙骨质表面的附着与增殖，在这一过程中起主要调控作用的是细胞因子和生长因子[2]。PRP是血液经离心后获得的含有较丰富的生长因子，其中以TGF-β和PDGF所占比例最大，而且，自体PRP克服了免疫原性和传染疾病的可能性。且体外实验结果显示，PRP可以促进牙周细胞在病变牙根表面的附着、增殖及细胞外基质胶原的形成[3,4]，本实验旨在研究不同浓度PRP在不同时间内对人牙周膜成纤维细胞在脱矿的病变牙根表面附着、增殖及对碱性磷酸酶活性的影响的情况，以进一步阐明PRP促进牙周组织再生的机制，为将PRP应用于临床奠定理论基础。

    1 材料与方法

    1.1 主要试剂与仪器 新鲜全血(遵义医学院中心血库)、标准胎牛血清(中国医学科学院生物工程研究所)、DMEM 培养基 (SIGMA,USA)、CO2培养箱(Shel Lab，USA)、洁净工作台(北京冠鹏净化设备有限公司)、倒置相差显微镜及照相系统(Olympus，JAPAN)、Centrifuge 5804R高速冷冻离心机(eppendorf，Germany)、Sysmex KX-21N 全自动血液分析仪(Germany)、噻唑盐(Biomol,USA)、对硝基磷酸二钠(p-Nitrophenyl Phosphate Disodium,pNPP,Sigma,美国)48孔板和96孔板(Becton Dickinsen Labware)、酶联免疫检测仪(BIO-TEK INSTRUMENTS.INC)。

    1.2 实验方法

    1.2.1 hPDLFs的体外培养鉴定 采用组织块法培养进行原代培养，选取因正畸需要、年龄在12至15岁之间、新鲜拔除的健康前磨牙，刮取根中1/3牙周膜组织，剪成1mm3大小，平铺于25mL培养瓶瓶底，加入2mL DMEM培养液(为含25%胎牛血清，100U/mL青霉素，100U/mL链霉素置于饱和湿度、5%CO2、95%空气、37℃的标准坏境下)中培养，倒置相差显微镜下观察细胞的生长状况，待细胞长满瓶底的85%时加入预热至37℃的0.25%胰蛋白酶消化并进行传代，取第5代细胞用于实验,实验前利用免疫组化ABC法进行细胞胞浆波形丝蛋白和角蛋白染色 ......