曾 霓，冯国丽，文坤明，曾庆良

    (1.遵义医学院2006级本科实习生；2.遵义医学院附属医院胃肠外科，贵州 遵义563000)

    Christopher[1]发现，在Dukes A期和B期结直肠癌患者中，有近30%在5年内死于肿瘤复发或转移，提示可能有结直肠癌微转移的存在。而淋巴结是否转移是制定其临床分期、指导手术治疗和判断预后的重要指标之一。研究表明[2,3]，结直肠癌患者机体处于免疫抑制状态，且发生复发和转移时患者机体免疫功能尤为低下。目前结直肠癌患者免疫学功能状态和其淋巴结微转移关系方面的研究尚未见报道。本实验采用PT-PCR方法检测结直肠癌患者淋巴结CK20mRNA(微转移)的表达，同时检测其血清CD4+、CD8+和NK水平探讨结直肠癌淋巴结微转移与免疫功能的关系。

    1 材料与方法

    1.1 材料与对象 实验组：本院2008年4月至2009年12月住院的结直肠癌患者21例，其中男14例，女7例，年龄24~78岁；对照组：健康志愿者21例，其中男15例，女6例，年龄24~67岁。；采集上述患者281枚淋巴结、术前3日外周静脉血及健康志愿者外周静脉血各5ml；

    排除标准：合并有免疫系统或感染性疾病;60天内接受放、化疗或使用影响免疫功能的药物;合并肿瘤并发症及发生肿瘤远处转移的患者。

    1.2 试剂与实验仪器 试剂：Trizol RNA抽提剂、PrimeScripTMRT Reagent Kit、SYBR ○RPremix EXTaqTM (Perfect Real Time)、SimultestTMIMKLymphocyte Kit、CK20基因及内参管家基因GAPDH引物，序列如下：CK20 F：5’-ggacgacacccagcgtttatg-3’，R:5’-caccgtgtgtctggagttgga-3’；管家基因 GAPD H F：5’-tggtgagacgccagtgga-3’，R:5’-gcaccgtcaaggct gagaac-3’。

    实验仪器：U-301型紫外分光光度计(日本HITACHI公司)；ICycler iQ型荧光定量PCR仪(美国BIO-RAD公司)；Syngene型凝胶成像分析系统(基因公司)；FACS Calibur流式细胞仪(Becton Dickinson公司)。

    1.3 方法

    1.3.1 淋巴结CK20mRNA的检测

    1.3.1 .1 淋巴结标本的采集与处理 新鲜标本挤压触诊法行淋巴结检取 ......