刘艳枚，刘小慧，方 宁，刘金伟，章 涛

    (遵义医学院附属医院暨贵州省细胞工程重点实验室，贵州 遵义 563000)

    干细胞临床转化应用寄托了各种难治性组织损伤疾病治疗的新希望[1，2]。除了干细胞直接移植应用外，将干细胞作为基因治疗的载体，由此形成基因与干细胞的联合也是重要的新的研究关注点[3]。这一治疗新策略成功的前提是选择易于病毒载体转染的干细胞类型，并将病毒转染干细胞带来的可能伤害降至最低。骨髓间充质干细胞(bone marrow derived-mesenchymal stem cells，BMMSCs)是最具应用前景的成体干细胞来源，在肢体缺血性疾病等的治疗应用研究中已取得了理想的结果[4]。最近，已有采用基因修饰BM-MSCs的治疗实验研究报道，初步证实了采用BM-MSCs携带外源基因治疗的可行性[5]。本研究选择具有促进血管新生的血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)，用腺病毒介导VEGF基因转染大鼠BM-MSCs，通过转染报告基因表达、转染效率和细胞活性检测等评价该策略的可行性，为VEGF基因修饰大鼠BM-MSCs移植治疗糖尿病下肢缺血等慢性缺血性疾病奠定基础。

    1 材料与方法

    1.1 病毒与细胞株 含人VEGF165基因腺病毒表达载体Ad-VEGF165与空载体Ad-GFP均由苏州大学杨吉成教授惠赠;HEK293细胞株为本实验室存留。

    1.2 主要试剂与仪器 FITC anti-rat CD29、PE anti-rat CD90和PE anti-rat CD45购自BioLegend公司;LG-DMEM培养基、HG-DMEM培养基、胎牛血清(FBS)为Gibco公司产品;碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)购自 Sigma公司。主要仪器:FACS Calibur流式细胞仪(Becton Dickinson);Leica Mirb倒置荧光显微镜 (Nikon);Vi-CELLTM XR细胞计数仪(Beckman Coulter)。

    1.3 实验动物 实验用SD大鼠购自第三军医大学附属大坪医院实验动物中心，动物实验符合有关伦理要求。

    1.4 大鼠BM-MSCs的分离培养与免疫表型分析 颈椎脱臼法处死2～3周龄SD大鼠，无菌条件下切取双侧完整股骨，剪开其两端 ......