邓文文，赵然尊，龙仙萍，石 蓓

    (遵义医学院附属医院 心血管内科， 贵州 遵义 563099)

    成年小鼠心脏干细胞的体外分离及表型鉴定

    邓文文，赵然尊，龙仙萍，石 蓓

    (遵义医学院附属医院 心血管内科， 贵州 遵义 563099)

    目的建立稳定的小鼠心脏干细胞(cardiac stem cells，CSCs)分离方法，并对体外培养的CSCs进行生物学特性鉴定。方法选用健康成年CD1小鼠，在无菌条件下取心脏并剪碎，并用II型胶原酶和胰蛋白酶反复消化，采用差速离心法去除混合细胞悬液中的心肌细胞，结合免疫磁珠分选法纯化c-kit+CSCs后，进行流式细胞仪表面标记鉴定。结果酶消化法和磁珠分选法结合成功分离并纯化了成年小鼠c-kit+CSCs。磁珠分选前，流式细胞仪表面标记鉴定c-kit+CD34-CSCs为4.62%；经磁珠分选后c-kit+CD34-CSCs可达70.23%。结论酶消化法结合磁珠分选法能成功分离纯化成年小鼠c-kit+CSCs，且能用于后续体外培养。体外培养时c-kit+CSCs相对于其它表型标记的心脏干细胞更加稳定，具有较强的扩增能力。相对于心脏组织块培养法，酶消化法可在短期内获得高纯度的c-kit+CSCs，更有助于心脏干细胞相关信号通道的体外实验研究。

    心脏干细胞；细胞分离；酶消化法；磁珠分选法;小鼠

    在成年哺乳动物的心脏组织内，心脏干细胞数量较少，分离较为困难[1]。而临床治疗需要大量的CSCs，这就使得CSCs的临床应用受到极大的限制。迄今为止，CSCs的分离方法甚至不能完全满足CSCs的相关研究。目前主要有两种方法用于分离鼠和人CSCs，一种是酶消化法[2]，另一种是原代组织贴壁培养法[3]。最近，S.H.choi及其同事首次证实了，尽管上述两种方法最终所得到的c-kit+CSCs细胞数量大致相同，然而，酶消化法所获得的CSCs具有更高的增殖潜能，更能满足临床治疗对干细胞数量的需求，且酶消化法所获得的CSCs表面的c-kit表达量更高[4]。本课题组经过探索已形成较为稳定的酶消化法分离CSCs，可为CSCs修复受损心脏的临床治疗策略提供可靠的实践依据。

    1 材料与方法

    1.1 实验动物 随机选择清洁级成年CD1小鼠，体重60～100 g，雌雄不限，购自第三军医大学实验动物中心。

    1.2 实验试剂和药品 II型胶原酶(Sigma-Aldrich)、0.25%胰蛋白酶(不含EDTA，Hyclone)、DMEM高糖培养基(GBICO)、优质胎牛血清(Fetal bovine serum, FBS, Hyclone)、青链霉素双抗(索莱宝)、包被羊抗兔二抗的磁珠(Dynal Biotech ......