陈 超，赵娟娟，胡 艳，郭萌萌，陶弋婧，周 涯，秦娜琳，郑 静，徐 林

    (1.遵义医学院 免疫学教研室暨贵州省免疫学研究生创新基地，贵州 遵义 563099；2.遵义医学院 医学物理学教研室，贵州 遵义 563099)

    近年来研究显示，一类长度大约22nt的非编码小分子RNA-微小RNA(microRNA,miRNA)在肺癌发生中具有关键调控作用，且逐渐发展为肺癌临床诊断和基因治疗的重要靶标[1-4]。新近研究显示miRNAs家族成员miR-7在肺癌发生中具有重要作用，其低表达与肺癌的转移相关[5]。我们前期研究发现miR-7模拟物(mimics)可显著抑制人肺癌细胞的体外增殖[6]。此外，基于CMV启动子的miR-7的真核表达载体过表达miR-7可显著抑制人肺癌细胞体内外生长、侵袭和转移[7-9]。然而，miR-7为代表的miRNAs分子是否可作为临床肺癌基因治疗或诊断靶标仍待继续研究探讨。

    甲状腺转录因子-1(thyroid transcription factor-1,TTF-1)基因是1989年civitarale等在甲状腺滤泡上皮细胞中发现的一种转录因子，其特征性表达于甲状腺滤泡上皮细胞和肺上皮细胞中[10]。研究发现TTF-1在肺癌组织中高表达，且其表达水平与肺癌预后密切相关，提示其可作为肺癌基因靶向表达的重要候选靶标[11-12]。因此本研究中，我们拟利用分子克隆技术，构建TTF-1启动子调控miR-7的真核表达载体，并初步探讨该真核载体过表达miR-7对人肺癌细胞体外生长的可能影响，以期为后续基于miR-7的临床肺癌诊断和基因治疗新靶标开发提供前期实验基础。

    1 材料与方法

    1.1 材料和仪器 PCR试剂，Premix Ex Taq Version2.0，限制性内切酶，快速连接酶均购自Takara公司；引物合成由上海英骏公司完成，PGL3-basic载体购自Promega公司。质粒抽提试剂盒购自天根生化科技有限公司；DNA凝胶回收试剂盒购自碧云天公司。人源性肺巨细胞癌95D细胞株，购于中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所。DH5α大肠杆菌菌株由本实验室保存。SW-CJ-2FD型超净工作台(苏州净化设备厂)；空气恒温摇床(上海新苗医疗器械制造公司)；TD5A-WS台式低速离心机(湘仪仪器)；IX-51倒置显微镜(OLYMPUS)；低温台式高速离心机(Thermo公司)；-80℃超低温冰箱(Thermo公司)。

    1.2 PCR扩增miR-7基因 根据pri-miR-7序列设计引物 ......