梁大敏，束 波，杨加伟，生 欣，范 芳

    (遵义医学院 生物化学教研室，贵州 遵义 563099)

    肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是临床常见的恶性肿瘤之一，其发病机制和病因尚不明确。DNA双链断裂(double-stranded breaks，DSBs)是细胞最严重的一种损伤，可导致细胞失去分裂增殖能力而死亡，是抗癌药物致肿瘤细胞死亡主要机制。DNA依赖性蛋白激酶亚基(DNA-dependent kinase catalytic subunit，DNA-PKcs)是参与非同源重组修复(nonhomologous end-joining，NHEJ)的核心组分，在NHEJ、VDJ重组和维持端粒结构中起关键作用，同时可磷酸化诸多转录因子和修复基因[1-2]。除此之外，有研究报道DNA-PKcs与肝癌耐药有关[3-4]。本文将shDNA-PKcs转染肝癌耐药细胞株BEL7402/5-FU，通过检测DNA-PKcs沉默对细胞化疗药物敏感性的影响，初步探索shDNA-PKcs与肝癌耐药的关系。

    1 材料与方法

    1.1 材料 BEL7402/5-FU细胞株购于南京凯基生物科技发展有限公司，PRNAi-U6.1-Neo shRNA质粒购于百奥迈科生物科技有限公司，Lipofectamine?2000Reagent购于Invitrogen公司，DNA-PKcs抗体购自Assay biotech公司，P-Glycoprotein(P-gp)抗体购自abcam公司，其余试剂均为国产分析纯试剂。

    1.2 方法

    1.2.1 shRNA质粒提取与鉴定 按质粒提取试剂盒提取质粒，经BamH I、Hind III双酶切后，琼脂糖凝胶电泳(1.0 %琼脂糖，120 V，30 min)，拍照。另取菌液1 mL送至百奥迈科生物技术有限公司测序。

    1.2.2 BEL7402/5-FU细胞的培养 将BEL7402/5-FU细胞于含10 %胎牛血清、20 μg/mL 5-FU的1 640培养液，37 ℃、5 %CO2条件下培养。细胞贴壁生长，每天换液1次，2～3 d传代1次，取对数生长期细胞用于实验。

    1.2.3 实验分组与质粒转染 实验分为4组：空白对照组、脂质体组、空质粒组、shDNA-PKcs实验组。将BEL7402/5-FU细胞接种于6孔培养板 ......