孔 萌，刘远梅, 金 祝,曲 颜，郑泽兵

    (遵义医学院附属医院 小儿普胸泌外科，贵州 遵义 563099)

    先天性肛门直肠畸形 (anorectal malformation, ARM)是小儿最常见的消化道畸形之一[1]，虽本病的治愈率已显著提高，但术后部分ARM患儿仍可出现不同程度的污粪、便秘等排便功能障碍，给患儿的生活质量带来较大影响。目前已证实ARM患儿术后排便功能障碍与肠神经系统(enteric nervous system, ENS)发育异常密切相关[2]，而ENS发育异常又是如何影响其排便功能，作用机制仍不十分清楚。ENS起源于神经嵴细胞，进入肠道后逐渐迁移、增殖，缓慢集聚最终分化形成神经节细胞及胶质细胞[3]，在此过程中任何环节发生障碍均可影响神经节细胞的发育进而导致ENS发育不良。三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)作为一种重要的神经递质，主要参与神经元的增殖、分化、迁移、再生和修复，可影响ENS的发育，ATP功能的发挥必须与相应P2Y2受体结合[4]，P2Y2受体的多少可以间接反映ATP神经递质的功能。本实验通过乙烯硫脲(ethylenethiourea，ETU)制作ARM动物模型[5]，观察P2Y2受体在ARM胎鼠直肠末端中分布、表达情况，进一步探讨其在肠壁神经系统发育中的作用。

    1 材料与方法

    1.1 ARM动物模型的建立及分组 选用健康未经产成年SD大鼠40只(第三军医大学实验动物中心提供，SPF级)，其中雌鼠30只，雄鼠10只，体重200～250g，雌雄大鼠按3∶1 比例于晚10点合笼交配，次日清晨8点行雌鼠阴道涂片，光学显微镜(×100)暗视野下以见到精子记为孕0d，每只孕鼠分别于妊娠第0天和第10天进行称重，增重不明显的孕鼠不包括在本实验内，以排除流产和假孕现象。选取明确受孕的20只雌鼠随机分成两组：实验组与正常组各10只，实验组在孕10d 一次性灌胃注入125mg/kg的1%乙烯硫脲，正常组在孕10d灌胃注入等量生理盐水。两组孕鼠在孕20d剖宫取出所有宫内胎鼠，观察有无畸形，并取出部分胎鼠直肠末端保存于-80℃冰箱，其余标本用4%甲醛溶液固定12～36h，常规脱水，石蜡包埋。

    1.2 主要仪器及试剂 实时定量PCR仪(美国Bio-Rad公司)、Leica Qwin图像分析系统(德国Forma Scientic)、双色红外激光成像系统(美国GDYSSEY公司)、光学显微镜(德国Leica公司)、ETU(Sigma ......