文坤明，傅仲学

    (1.遵义医学院附属医院 胃肠外科，贵州 遵义 563099；2.重庆医科大学第一附属医院 胃肠外科，重庆 400016)

    第3代铂类制剂奥沙利铂与5-FU和亚叶酸钙联合应用的FOLFOX化疗方案使得转移性结直肠癌的有效率超过50%，但仍有约40%的病例对FOLFOX方案无反应，出现耐药[1]。目前，通过建立耐药细胞株来研究肿瘤耐药的机制及其对抗或逆转耐药策略成为目前研究热点。在本实验中我们建立了一种结直肠癌耐奥沙利铂细胞株，检测了它的多药耐药特性及其可能机制。

    1 材料与方法

    1.1 材料 人结直肠癌细胞株SW480购自中国科学院上海细胞库；胎牛血清(FBS)购自美国HyClone公司；Leibovitz’L-15培养基购自北京迈晨公司；RNA提取试剂盒购自北京天根公司；逆转录试剂盒、SYBR TAQ Real time试剂盒购自大连宝生物公司；全蛋白提取试剂盒购自南京凯基生物有限公司；兔抗人Oct4、Survivin一抗购自美国Eptomics公司；鼠抗人P-pg一抗购自美国Santa-Cruz公司，鼠抗人β-actin一抗及山羊抗兔二抗购自北京中杉金桥公司；奥沙利铂购自美国Sigma公司；WST-1购自瑞士Roche公司。

    1.2 耐药细胞株的建立方法 SW480细胞株在含10%FBS的L-15培养基中培养。为建立稳定的耐药细胞株，在该细胞的培养液中持续加入Oxa、并将其浓度由低至高逐渐提高。起始Oxa浓度为0.1 μmol/L，待存活细胞增殖、细胞融合度达80%左右后予传代，传3代后增加Oxa浓度(后同)，经过提高其浓度为0.5 μmol/L及1.0 μmol/L后，最终达临床相关血药浓度2.0 μmol/L时，传5代以上后用于后续实验，所有实验至少重复3次。由SW480细胞株最终所建立的稳定的耐Oxa细胞株用“SW480/OxR”来表示。

    1.3 细胞增殖活力检测 采用细胞增殖试剂WST-1检测细胞增殖能力。按照我们之前报道的方法[2]，将耐药细胞及亲本细胞分别暴露于含2 μmol/L的Oxa及2 μg/L的5-FU培养液中(每组设5个复孔)，分别在24、48、72 h后加入细胞增殖试剂WST-1，用酶标仪在570 nm波长下测定各组细胞平均吸光度值(A值)，以该A值反映细胞增殖能力并鉴定SW480/OxR细胞的耐药性。

    1.4 实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测mRNA表达 用细胞RNA提取试剂盒提取各组细胞的RNA，并将其逆转录成cDNA ......