陈峻崧，杨 洁，邵家胜，洪晓武

    (1.东南大学医学院 病原生物学与免疫学系，江苏 南京 210009；2.江苏先声药业有限公司,江苏 南京 210042；3.上海复旦大学附属公共卫生临床中心 内科学系，上海 201508；4.复旦大学基础医学院 免疫学系，上海 200032)

    卵巢癌是发病率第3位的女性生殖器恶性肿瘤，占女性恶性肿瘤的5%。但因卵巢癌致死者，却占各类妇科肿瘤的首位[1-2]；中国女性的卵巢癌发病率为3.8/10万，每年有1.2万人死于卵巢癌[3]。卵巢癌复发率高，五年生存率仅有15%～30%，主要原因是耐药而导致的复发[2，4]。卵巢癌干细胞(Ovarian Cancer Stem cells,OCSCs)常被描述为与卵巢癌发生、发展、转移、抗辐射、耐药和复发密切相关的肿瘤细胞[5-6]，含量极低。OCSCs作为卵巢癌治疗中的重要靶细胞，OCSCs生物学特性的研究日益增多，在人上皮卵巢癌(Human Epithelial ovarian cancer,EOC)中分离的一部分表型为CD44+CD117+的细胞，被证实具有更高的顺铂和紫杉醇耐受性和在裸鼠中具有高致瘤性[7]。但是针对OCSCs的靶向抗肿瘤药物仍未被开发出，因此，深入了解OCSCs的耐药机制，寻找靶向消灭OCSCs的药物是治愈卵巢癌的关键。

    1 资料与方法

    1.1 人OCSCs分选收集对数生长期的人EOC HO8910细胞 用免疫磁珠分选(magnetic-activated cell sorting,MACS)Buffer(MACS- Runnning Buffer:PBS pH 7.2 + 2 mM EDTA +0.5% BSA)重悬细胞，白细胞计数板镜下计数，每107个细胞重悬于80 μL Buffer中；CD44磁珠抗体标记，每107个细胞加入20 μL的CD44磁珠单抗，混匀后4 ℃冰箱中孵育15 min；采用LS Columns柱，正性分选，过柱收集CD44+细胞后计数。再加入100 μLCD117磁珠单抗，混匀后在4 ℃冰箱中孵育45 min，再次过柱收集CD44+CD117+细胞，计数、放入培养瓶中，加入干细胞培养液，注意无菌操作。

    1.2 人OCSCs的无血清培养与鉴定 CD44+CD117+细胞加入干细胞培养液在培养瓶中置37 °C、5%CO2饱和湿度条件下常规细胞培养。无血清干细胞培养液[7]为DMEM/F12培养基加入5 μg/mL牛胰岛素，20 ng/mL人重组表皮生长因子，10 ng/mL成纤维生长因子和0.4%牛血清白蛋白配制而成；流式细胞术(Flow Cytometer ......