齐 波, 丁 晶

    (成都军区昆明总院 全军创伤骨科研究所，云南 昆明 650032)

    在自然选择的驱动下，细菌对外源基因的入侵已进化出多种防御机制，当外源基因侵入细菌时，一种成簇而规律间隔的短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)会将该基因片段整合保存，待相同基因片段再次入侵时，CRISPR及其相关蛋白会将该外源基因剪切破坏，细菌这种免疫防御功能不禁让人联想到基因沉默技术，能否利用CRISPR构建出新的基因沉默新技术呢？当Qi等[1]的研究给出肯定的答案时便开启了基因研究的新篇章。本文旨在介绍CRISPR干扰(CRISPR inference, CRISPRi)系统的基本结构和功能。

    1 CRISPR-Cas系统的结构及分类

    1.1 CRISPR位点 1987年Ishino等[2]报道在大肠杆菌碱性磷酸酶的同工酶Ipa中有一段呈“重复-间隔-重复”规律排列的序列，尔后发现这种结构在细菌和古细菌中普遍存在，并于2002年由Jansen等[3]统一命名为CRISPR。这些重复序列有较高保守性，一般由23 bp-50 bp组成，其间有5 bp-7 bp的回文序列，通常于此形成稳定的茎-环结构；在同一个CRISPR位点，重复序列基本相同，但不同微生物有不同CRISPR位点，在同一微生物中可能有多个CRISPR位点，不同CRISPR位点所含重复序列各不相同[4-5]；许多重复序列还含有GAAA(C/G)3'-端保守基序，其可能是Cas蛋白的结合位点[5]。间隔序列长为17 bp-84 bp，在同一个CRISPR位点该序列不同，研究表明它们可能来源于噬菌体、质粒[6]。

    1.2 Cas蛋白 2002年Jansen等[3]发现在CRISPR位点附近有一系列与之相关的基因(CRISPR-associated, Cas)，与之相对应的蛋白称为Cas蛋白，目前已从中鉴定出核酸内切酶、核酸外切酶，解螺旋酶及RNA-和DNA-结合的结构域，由此推断Cas蛋白可能参与CRISPR的转录、加工等过程[7]。随着人们对CRISPR系统的关注，目前已发现40余种Cas蛋白。在CRISPR位点上游存在一段(A+T)富集的前导序列(lead sequence)，其在CRISPR转录过程中起启动子的作用[8]。一言蔽之，CRISPR-Cas系统包括：由重复序列及间隔序列规律排列的CRISPR簇、前导序列和Cas基因构成(见图1) ......