杨加伟，李 伟，葛正龙

    (遵义医学院 生物化学教研室，贵州 遵义 563099)

    植物生物反应器具有操作简便、产物活性高、成本低、易扩大规模等优点，与微生物及动物细胞等其它生物反应器相比有独特的优势，因此在细胞因子、生长因子、抗体及疫苗等药用蛋白制造领域获得了广泛的研究和应用[1]。白细胞介素(IL)是一类体内含量极微的细胞因子，多为小分子糖蛋白，在传递信息，激活与调节免疫细胞，介导T、B细胞活化、增殖与分化，以及在炎症反应中均起着重要作用，目前已发现30多种。其中IL-12是由单核细胞、巨噬细胞分泌表达的一种细胞因子，具有多种生物学活性，在机体的抗肿瘤、抗病毒、抗过敏过程中均发挥着极其重要的作用，在临床上有着巨大的应用前景[2]。目前，虽已有商品化的重组IL-12出售，但价格极其昂贵，因此利用植物生物反应器高效表达生产IL-12，降低IL-12的生产成本，具有重大的应用价值。

    本实验室前期研究中，构建了CaMV-35S启动子驱动的hIL12表达载体并导入马铃薯基因组，获得了表达hIL12的转基因马铃薯植株，体外实验表明重组hIL12具有生物学活性，但表达量较低[3-4]。利用植物自身的组织特异性强启动子替代CaMV-35S等组成型启动子来驱动外源基因的表达，是提高重组蛋白表达量的有效途径[5]。马铃薯PATATIN蛋白是一类分子量约为40 kD的糖蛋白，其在马铃薯块茎可溶性总蛋白中的含量高达40%，而在其它组织中的含量极少[6]。因此，本研究拟从马铃薯基因组中克隆驱动patatin基因高效表达的组织特异性启动子(Ppatatin)，并对克隆的启动子进行生物信息学分析，然后构建其驱动的植物表达载体，为其在马铃薯生物反应器中的应用和提高hIL12的表达量打下基础。

    1 材料与方法

    1.1 实验材料与主要试剂 本研究用马铃薯材料中薯1号，由遵义市农科所提供。主要试剂有PCR反应液(Takara公司)、限制性内切核酸酶及DNA连接酶(Takara公司)、质粒提取试剂盒(TIANGEN公司)、琼脂糖(西班牙)等。克隆测序载体为pMD-18T，购买于Takara公司；双元表达载体pCAMBIA2301-MCS由中国热带农业科学院橡胶研究所赠送；大肠杆菌DH5α感受态细胞购于TIANGEN公司；质粒pIRES2-EGFP-hIL-12HSP70由本实验室保存。所用PCR引物由上海生工公司合成，引物序列(见表1)。

    表1引物序列 ......