王斯玮，杨 岚， 刘建国，顾 瑜 ，白朋元， 白国辉,3 ，田 源

    (1.遵义医学院 口腔学院，贵州 遵义 563099；2.贵州省高等学校口腔疾病研究特色重点实验室，贵州 遵义 563099；3.遵义医学院 医学与生物学研究中心，贵州 遵义 563099)

    纳米级矿化颗粒(Calcifyingnanoparticles,CNPs)，曾称之为纳米细菌(Nanobacteria),是芬兰科学家Kanjander教授团队在20世纪90年代发现的一种直径20～500nm，具有自我复制能力、能产生坚硬生物矿化外壳、参与病理性钙化形成，且具有细胞毒性的新型物质[1]。目前，由于缺乏可信的基因序列以及蛋白矿物质复合物学说的提出使得CNPs作为新型细菌的观点受到质疑[2-4]。虽然对CNPs的争论不断，但其作为病理性钙化病因学探究的一个新的切入点仍然具有重要研究意义。牙结石是病理性钙化在口腔疾病中的表现形式之一，也是牙周病重要的局部促进因素，其形成机制尚不清楚，CNPs的提出为牙结石的形成机理提供了新的方向。本实验通过对不同程度牙周病患者的龈上牙石、龈下结石进行CNPs的分离培养，比较不同牙位、不同性别CNPs的培养率以及对培养阳性的样本进行形态学初步观察，为探讨牙结石形成、牙周病病因学提供更多的思路。

    1 材料与方法

    1.1 研究对象 以2013年3月至9月就诊于遵义医学院附属口腔医院牙周科患者为研究对象,所有患者知情同意。记录患者口腔牙周情况后分为牙龈炎组10例、轻度牙周炎组10例、中重度牙周炎组10例，分别采集病人下前牙舌面及上颌磨牙颊面的龈上牙石、龈下牙石作为实验样本,其中牙龈炎组只采集龈上牙石,以上30例病例又根据性别再分为两组进行比较，所有样本均符合国际牙周病诊断标准[5]且均排除全身其他系统疾病。

    1.2 实验主要仪器、试剂 DMEM/F12培养基(Hyclone 公司)，胎牛血清(杭州四季青生物工程公司)，中性树胶(Solarbio公司)，医用净化工作台(苏州净化设备厂)，CO2恒温培养箱 (Themro公司)， 倒置相差显微镜及照相系统 (Olympus)，日立H-7650型透射电镜(日立公司)，HE染液，茜素红钙染液。

    1.3 实验方法

    1.3.1 CNPs的采集 分别采用龈上洁治器、龈下刮治器采集病人下前牙舌面及上颌第一磨牙颊面的龈上牙石、龈下牙石。其中牙龈炎组只采集以上两个位点的龈上牙石，样本分别装入含有1mL生理盐水的EP管中，冰盒运回实验室，-20 ℃冻存 ......